Pētījums par dziļās filtrācijas izmantošanu mutes un nagu sērgas vakcīnas ražošanas procesā

Priekšvārds - Kas ir mutes un nagu sērga

14. gadsimtā Eiropā ir rakstiskas ziņas par līdzīgu mutes un nagu sērgu. Mutes un nagu sērga ir akūta, drudžaina, ļoti lipīga slimība, ko izraisa mutes un nagu sērgas vīruss.

Pieaugušu dzīvnieku klīniskie simptomi ir: paaugstināta ķermeņa temperatūra, tulznas un čūlas mutē, tulznas un čūlas nagā un pat naga čaumalu izkrišana, kas izraisa grūtības ēst un gulēt, svara zudums un pat ekonomiskās vērtības zudums ekonomiskajiem dzīvniekiem. ;

Jaunu dzīvnieku klīniskie simptomi ir: paaugstināta ķermeņa temperatūra, miokardīts un citi simptomi, kad tie parādās, jauniem dzīvniekiem ir augsta mirstība.

 

Abstrakts

Pēdējo 500 gadu laikā mutes un nagu sērga ir atkārtoti uzliesmojusi visā pasaulē, un liels skaits cūku, liellopu, aitu un citu mājdzīvnieku un savvaļas pārnadžu ir miruši vai saslimuši, smagi ietekmējot mājlopus. un audzēšanas nozare.

 

Lai izpētītu dziļās filtrācijas tehnoloģijas pielietojumu mutes un nagu sērgas vakcīnas ražošanas procesā, tika pārbaudīta un salīdzināta virsmas filtrācijas un dziļās filtrācijas filtrējamības veiktspēja, kā arī baktericīdās filtrācijas aizsargājošā iedarbība. Tika pētītas augsta lādiņa dziļās filtrācijas priekšrocības šūnu atlieku izņemšanā. Tika analizētas atbilstošās filtrēšanas shēmas šūnu kultūras barotnei ar dažādu duļķainību.

 

Rezultāti parādīja, ka dziļās filtrācijas slodze bija 13,9 reizes lielāka nekā virsmas filtrācijas slodze, filtra šķidruma duļķainība bija tikai 23,5% no virsmas filtrācijas, un sekojošā 0.2um debakterializācijas slodze bija 7,2 reizes lielāka nekā virsmas filtrēšana. Izmantojot tā īpašo sveķu ligandu, filtra šķidruma duļķainība ir 38,6% no parastā dziļā filtra ar tādu pašu poru izmēru, kas ir izdevīgi, lai aizsargātu pakārtoto procesu. Rezultāti parādīja, ka dziļo filtrāciju, īpaši spēcīga pozitīva lādiņa dziļo filtrāciju, var efektīvi izmantot mutes un nagu sērgas vakcīnas ražošanā, un ir jāizveido piemēroti filtrēšanas procesi dažādām barotnēm.

 

Mutes un nagu sērga un dziļā filtrācija

Mutes un nagu sērga (FMD) ir akūta, febrila un lipīga pārnadžu slimība, ko izraisa mutes un nagu sērgas vīruss (FMDV). Dzīvnieki, kas ir visvairāk uzņēmīgi pret šo slimību, ir liellopi, cūkas un aitas. Mutes un nagu sērga ir endēmiska Āzijā, Āfrikā, Tuvajos Austrumos un Dienvidamerikā, ar ļoti augstu sastopamības biežumu un ātru izplatību. Pasaules Dzīvnieku veselības organizācija (OIE) to uzskaitījusi kā pirmās A kategorijas zoonozes slimību, liekot dalībvalstīm iekļaut mutes un nagu sērgu paziņoto dzīvnieku slimību sarakstā. Vakcinācija ir efektīvs līdzeklis specifiskai mutes un nagu sērgas profilaksei. Mutes un nagu sērgas inaktivētai vakcīnai, ko ražo, inaktivējot neskartu vīrusu ar inaktivatoru, ir svarīga loma mutes un nagu sērgas profilaksē un kontrolē.

Pati FMDV antigenitāte ir slikta, un vīrusa inaktivācijai ir liela ietekme uz tā antigēnu. Tāpēc pašreizējā mutes un nagu sērgas vakcīnas ražošanā augstas tīrības pakāpes mutes un nagu sērgas vakcīna var nodrošināt antigēna saturu un tīrību devas vienībā, kas ir īpaši svarīgi un ir arī pašreizējā vakcinācijas stratēģija. Tas izvirza augstas prasības vīrusu pakārtotajai attīrīšanai. Turklāt pirms 2009. gada inaktivētās mutes un nagu sērgas vakcīnas Ķīnā pārsvarā izmantoja kultivēšanas metodi, grozot pudeli un pielīmējot pie sienas. Pieaugot pieprasījumam pēc vakcīnām, pakāpeniski parādījās šīs kultivēšanas metodes trūkumi, kas prasa lielu skaitu rotējošu pudeļu, zemu efektivitāti un zemu ekspresijas līmeni.

Tāpēc pēdējos gados šūnu kultūras tehnoloģija ir lēnām mainījusies no iepriekšējās adherentās kultūras uz suspensijas kultūru, un vīrusu ražošana ir ievērojami uzlabojusies. Taču, palielinoties vīrusa ražošanai, kultivēšanas režīma maiņa ir radījusi lielāku spiedienu uz pakārtoto attīrīšanu, jo attiecīgi palielinājās kultivēšanas procesā radušās šūnu atliekas, saimniekproteīnu, saimnieka DNS u.c. izvirza papildu prasības pakārtotās attīrīšanas spējai.

Membrānas filtrēšanas tehnoloģija tiek plaši izmantota bioloģisko produktu, piemēram, vakcīnu, ražošanas procesā, tostarp līdzstrāvas filtrēšanas tehnoloģiju parasti izmanto slimības indes savākšanas procesā, lai atdalītu nešķīstošus piemaisījumus, piemēram, šūnu atliekas. Agrīnā FMDV skaidrojumā galvenokārt tika pieņemta virsmas filtrēšanas tehnoloģija, ko pārstāv salokāmais membrānas filtra elements. Mainoties kultivēšanas apstākļiem, palielinoties šūnu atlieku piemaisījumu daudzumam, virsmas filtrēšanai ir grūti sasniegt dzidrināšanas efektu, un, tā kā virsmas filtrēšanas slodze ir zema, filtru materiālu izmaksas kļūst arvien augstākas.

 

Ņemot vērā iepriekš minēto, FMDV citošķidruma atdalīšanas procesā arvien vairāk tiek izmantota dziļa filtrēšana. Dziļā filtra materiāls parasti sastāv no garām un smalkām šķiedrām no dabīgiem avotiem, un kanāls, ko veido filtra vide pēc plēves veidošanas, bieži ir ļoti līkumots, līdzīgs labirinta atvēruma struktūrai. Piemaisījumu daļiņas bieži tiek ieslodzītas filtra iekšpusē, nevis uz virsmas. Turklāt filtra kanāla siena bieži absorbē daļu īpaši smalku daļiņu piemaisījumu ar elektrostatisko iedarbību vai starpmolekulāro spēku. Kopumā dziļās filtrācijas filtrēšanas mehānismu raksturo mehāniska aizturēšana un adsorbcija.

 

Pastāvīgās strāvas filtrēšanas metode

Uzstādiet dziļo filtra plāksni uz pastāvīgās strāvas filtra ierīci, nomazgājiet filtra plāksni ar buferšķīdumu PBS virs 54 L/m2; Kad mazgāšana ir pabeigta, iedarbiniet peristaltisko sūkni, lai lēnām sūknētu šķidrumu, lēnām noregulējiet sūkņa ātrumu līdz aptuveni paredzētajam plūsmas ātrumam un filtrējiet šķidrumu. Reģistrē filtrēšanas tilpumu, laiku, spiediena starpību un duļķainību filtrēšanas procesa laikā. Filtrāts tika savākts antigēna noteikšanai.

 

Dziļās filtrēšanas priekšrocības

Virsmas filtrēšana ir tehnoloģija, kas uztver daļiņas uz filtra materiāla virsmas, lai panāktu filtrēšanu. Filtrēšanas mehānisms galvenokārt balstās uz daļiņu izmēru šķidruma sietā, lielas daļiņas tiek notvertas uz filtra membrānas virsmas. Dziļā filtrācija izmanto iekšējos kanālus daļiņu pārtveršanai un adsorbcijai dziļumā. Abu salīdzināšanas diagramma ir parādīta 1. attēlā.

Noteikta ražotāja mutes un nagu sērgas vakcīnas inaktivētais šķīdums tika iepriekš filtrēts ar 0,45 um polipropilēna virsmas membrānu un dziļo filtra plāksni un pēc tam filtrēts ar 0,2 um baktericīdo filtru. Filtrējamības dati ir parādīti 1. tabulā.

 

Mutes un nagu sērgas vakcīnas inaktivētā šķīduma duļķainība ir 77 NTU. Ja baktērijas tiek filtrētas tieši, liels skaits šūnu fragmentu neizbēgami izraisīs 0.2um filtra membrānas ātru bloķēšanu, kas ietekmēs 146S vidaļiņu pārnešanu. Tāpēc pirms debakterializācijas filtrēšanas tika izstrādāta priekšfiltrācija, un tika salīdzinātas divas pirmsfiltrācijas metodes dziļās filtrācijas un virsmas filtrācijas. Filtrēšanai ir izvēlēta divslāņu dziļā filtra plāksne, slodze ir 641 L/m2, un dziļais filtrs samazina materiālu 77 NTU līdz 9,65 NTU, kas ir dzidrs un spilgts. Virsmas filtrēšanas slodze 0.45um ir tikai 46 l/m2, un filtra šķidruma duļķainība ir 41 NTU, kas nav piemērota priekšfiltrācijai. Saskaņā ar sekojošās 0.2um debakterializētās filtrācijas slodzes salīdzinājumu, debakterializētās filtrācijas membrānas slodze pēc dziļās filtrācijas ir 655 L/m2, kas ir 7,2 reizes lielāka par atbilstošo virsmas filtrācijas filtrācijas slodzi (tikai 91 L/m2) .

146S testa rezultāti liecina, ka dziļās filtrācijas sistēmas ražība ir augstāka nekā virsmas filtrācijas sistēmai. Dziļās filtrācijas slodze bija 13,9 reizes lielāka nekā virsmas filtrācijai, filtra šķidruma duļķainība bija tikai 23,5% no virsmas filtrācijas, un sekojošā 0,2 um baktērijas noņemošā filtrācijas slodze bija 7,2 reizes lielāka nekā filtrēšanas slodzei virspusē. virsmas filtrēšana. Tāpēc gan no izmaksu, gan no ražas viedokļa dziļās filtrēšanas sistēma ir ievērojami labāka nekā virsmas membrānas filtrēšanas sistēma.

 

Spēcīga pozitīva lādiņa dziļā filtra priekšrocības

Pozitīvā lādiņa dziļā filtra plāksne un spēcīga pozitīvā lādiņa dziļā filtra plāksne tika izmantota, lai salīdzinātu dažādu avotu mutes un nagu sērgas vakcīnas inaktivēto šķīdumu. Filtrējamības rezultāti ir parādīti 2. tabulā, bet filtrācijas ātruma un spiediena starpības izmaiņas filtrēšanas procesā ir parādītas 2. krāsu izkārtojumā.

Abām izmantotajām dziļo filtru plākšņu grupām ir vienāda atvēruma precizitāte, un veiktspēja ir ļoti konsekventa no slodzes un spiediena starpības izmaiņu viedokļa, un spiediena starpības izmaiņu līkne 2. attēlā būtībā ir identiska.

 

Tomēr no filtra šķidruma duļķainības atšķirība ir ļoti liela. Parastās pozitīvi lādētās divslāņu filtra plāksnes filtra šķidrums ir 25 NTU, savukārt spēcīgi pozitīvi lādētas dziļā slāņa filtra plāksnes filtra šķidrums ar tādu pašu atvērumu ir tikai 9,65 NTU, kas ir tikai 38,6% no parastās dziļās filtra plāksnes. Tas galvenokārt ir saistīts ar īpašo sveķu ligandu spēcīga pozitīvā lādiņa dziļā filtra plāksnes filtra materiālā. Duļķainība tiek samazināta līdz mazāk nekā 10 NTU, izmantojot izteikti pozitīvo divslāņu filtra plāksni, un šūnu fragmenti tiek pilnībā adsorbēti vai notverti, kas veicina turpmāko ultrafiltrācijas vai baktericīdo filtrēšanas procesu. Papildus adsorbcijas efektam uz nešķīstošām šūnu atliekām Yigzaw Y et al ir ziņojuši arī par spēcīgi pozitīvi lādētas dziļās filtra plāksnes noņemšanas efektu uz šūnu saimnieka proteīnu, un Dorsey N et al ir ziņojuši par spēcīgi pozitīvi lādētas dziļās filtra plāksnes noņemšanas efektu. uz DNS.

 

Dzidrināšanas filtrēšanas procesa izveide mutes un nagu sērgas vakcīnas supernatantam ar dziļo filtrēšanu

Izmantojot iepriekš minēto salīdzinošo virsmas filtrācijas un dziļās filtrācijas pētījumu, kā arī īpašās spēcīgas pozitīvas lādiņa dziļās filtra plāksnes dzidrināšanas efekta izpēti, dažādas filtrēšanas shēmas ir jāsaskaņo ar inaktivētu mutes un nagu sērgas vakcīnas supernatantu, kas ražots dažādos apstākļos. kultūras apstākļi. Centrbēdzes supernatantam ar 3 dažādu duļķainību, zemu duļķainību, vidēju duļķainību un augstu duļķainību dziļās filtrācijas shēma un atbilstošie filtrācijas parametri ir parādīti 3. tabulā.

Centrbēdzes supernatantam ar zemu duļķainību viena slāņa dziļā filtra plāksne var efektīvi notīrīt un noņemt nelielu daudzumu šūnu atlieku. Vidēja duļķainuma centrbēdzes supernatantam divslāņu dziļā filtra plāksne var efektīvi notīrīt, jo īpaši spēcīga pozitīvā lādiņa dziļā filtra plāksne var samazināt duļķainību līdz mazākam par 5 NTU; Centrbēdzes supernatantam ar lielāku duļķainību kombinēto filtra plāksni var efektīvi notīrīt. Neatkarīgi no procesa, apstrādes jauda ir 500 ~ 800 l/m2, filtra šķidruma duļķainība ir mazāka par 20 NTU, un mērķa antigēns ir pilnībā atgūts, piemērots liela mēroga ražošanai.

 

Diskusija

1970. gados tika noteikts, ka filtru vidē nedrīkst izmantot azbesta materiālus, jo azbesta materiālos ir kancerogēni. Dziļā filtra materiāls nesatur azbestu un tam ir spēcīgāks pozitīvais lādiņš. Filtra materiāls ir izgatavots no kokšķiedras matricas un filtra palīglīdzekļa. Ražošanas procesā pamatkomponentu savienošanai izmanto polimēru sveķus, un tajos esošās pozitīvā lādiņa funkcionālās grupas efektīvi dod dziļā filtra materiāla lādiņa adsorbcijas spēju. Adsorbtīvās dziļās filtrācijas lieliskā veiktspēja smalko daļiņu uztveršanas spējai ir parādīta 3. attēlā.

Šajā eksperimentā tika izvēlēti dažādi sveķu komponenti un dažādi precīzi dziļfiltru materiāli, lai precizētu FMDV kultūras šķīduma filtrēšanas testu, un salīdzināšanas tests tika veikts ar virsmas filtrāciju. Rezultāti parādīja, ka dziļā filtrēšana bija piemērotāka šūnu atlieku noņemšanai nekā virsmas filtrēšana, kas bija labvēlīga turpmākajai mikrobu slodzes kontroles filtrācijas iekārtai (0.2um). Turklāt, salīdzinot spēcīga pozitīvā lādiņa dziļā filtra plāksnes un parastās pozitīvā lādiņa dziļā filtra plāksnes filtrēšanas efektu, spēcīga pozitīvā lādiņa filtra plāksne parāda spēcīgu duļķainības kontroles spēju, kas var samazināt duļķainību līdz mazākam par 5 NTU, kas ir ļoti labvēlīgs visa filtrēšanas procesa noturības uzlabošanai.

Augšējā kultivēšanas procesam ir liela ietekme uz aktīvo sastāvdaļu novākšanas soļiem. Pārbaudot, šis eksperiments beidzot izveidoja mērogojamu filtrēšanas shēmu šūnu kultūras barotnēm ar dažādu duļķainību, kam ir noteikta vadošā nozīme liela mēroga ražošanā.

Dziļuma filtrs, ko laidīs klajā Guidling Technology, ir diska tipa filtra elements, kas ir sava veida efektīvs filtra elements ar dziļo filtra kartonu kā filtra materiālu, kas pilnībā atbilst biofarmaceitisko līdzekļu normatīvajām prasībām, galvenokārt izstrādāts un ražots speciāli, lai noņemtu liels cietais saturs, piemēram, šūnas un šūnu fragmenti, un to var izmantot zīdītāju šūnu kultūras šķidrumam; Baktēriju un rauga šūnu lizāta attīrīšana; saimniekšūnu proteīna (HCP) noņemšana; Noņemt vīrusu un DN; Endotoksīnu izvadīšana; Putu slāpētāja noņemšana.

Produktam ir maza tilpuma, lineārā pastiprinājuma, diska kapsulas struktūras, kompaktas struktūras dizaina priekšrocības, un to var izmantot sērijveidā ar citām iekārtām, nelielu nospiedumu, stabilu plūsmas ātrumu, ilgu kalpošanas laiku un zemām izmaksām.