Pakārtots ultrafiltrācijas/diafiltrācijas koncentrēšanas process: kā efektīvi novērst mērķa proteīna caurlaidību un zudumu

Pakārtots ultrafiltrācijas/diafiltrācijas koncentrācijas process: kā efektīvi novērst mērķa proteīnu caurlaidību un zudumu

Pakārtotajos rekombinanto proteīnu, asins produktu un citu bioloģisko vielu attīrīšanas procesos ultrafiltrāciju/diafiltrāciju (UF/DF) izmanto izejvielu koncentrēšanai, bufera apmaiņai un sāļu un mazu{0}}molekulu piemaisījumu noņemšanai. Atdalīšana tiek panākta, pamatojoties uz membrānas sijāšanu: lielas molekulas, piemēram, monoklonālās antivielas (mAb), tiek aizturētas membrānā, bet sāļi, endotoksīni, brīvie saimniekšūnu proteīni (HCP) un citi mazi -molekulu piemaisījumi iziet cauri membrānai un tiek noņemti permeātā. Procesa apjoma palielināšanas- laikā var viegli notikt mērķa proteīna zudums caur membrānu, tieši samazinot ražu un palielinot partijas izmaksas. Dažos darbības apstākļos permeātā var tikt konstatēts proteīns, tāpēc ātri jānosaka, vai noplūdušie komponenti ir neskarti mērķa mAb, degradēti/fragmentēti agregāti vai saimniekšūnu proteīni. Šis raksts ir sadalīts divās galvenajās daļās: tajā ir aplūkotas tradicionālās procesa kontroles pieejas un kopā ar eksperimentu plānošanu (DOE) tiek izveidots stabils procesa logs, ko atbalsta vairākas analītiskās metodes, lai noteiktu permeātā konstatēto proteīnu identitāti.

 

 

I. Galvenie cēloņi mērķa proteīna caurlaidībai caur membrānu UF/DF laikā

1. Pārmērīgs transmembrānas spiediens (TMP)
Ja spiediena starpība visā membrānā ir pārāk liela, šķīdinātāja pretestība tiek pastiprināta, piespiežot dažus monomērus proteīnus permeātā. Palielināšanas laikā-padeves tvertnē ir lielāks materiāla daudzums, un spiediena svārstības cauruļvados ir izteiktākas, tādēļ pārejoša pārspiediena iespējamība ir lielāka nekā laboratorijas mērogā.

2. Nepareizs tangenciālais plūsmas ātrums
Ja plūsmas ātrums ir pārāk mazs, uz membrānas virsmas veidojas blīvs koncentrācijas -polarizācijas slānis, un vietējā proteīna koncentrācija var pārsniegt membrānas tolerances slieksni. Ja plūsmas ātrums ir pārāk liels, bīdes spriegums var izraisīt mAb strukturālu šķelšanos, radot mazākus proteīna fragmentus, kas var brīvi iziet cauri membrānas porām.

3. Pārmērīgi augsta olbaltumvielu koncentrācija izejvielās
Ja olbaltumvielu koncentrācija barībā ir pārāk augsta, olbaltumvielas uzkrājas uz membrānas virsmas, un daži monomēri proteīni var tikt pārnesti permeātā. Tā ir izplatīta problēma liela mēroga-ražošanā.

4. pH vai vadītspēja ārpus procesa diapazona
Proteīna lādiņa raksturlielumu izmaiņas var samazināt tā hidratācijas rādiusu un šķietamo daļiņu izmēru, izraisot patoloģisku membrānas caurlaidību.

5. Membrānas kasešu novecošana, liela difūzā plūsma vai nepietiekama iepriekšēja-kondicionēšana
Membrānas kasetes fiziski defekti var tieši izraisīt olbaltumvielu noplūdi un radīt ar aprīkojumu{0}}saistītu risku. Atkārtota CIP ar stipri sārmainiem šķīdumiem var pakāpeniski sabojāt poliētersulfona (PES) membrānas materiālu.

6. Pārmērīgs diafiltrācijas apjoms
Ilgstošas ​​diafiltrācijas laikā nepārtraukta šķīdinātāja skalošana var pakāpeniski izvadīt nelielu daudzumu monomēra proteīna.

 

II. Tradicionāli praktiski pasākumi, lai novērstu mērķa proteīna caurlaidību un zudumu

(A) Procesa parametru vadība

1. Transmembrānas spiediena kontrole (TMP)
Definējiet augšējo spiediena brīdinājuma robežu un izveidojiet bloķēšanas trauksmes signālus, lai novērstu pārejošu augsta spiediena ietekmi uz membrānas slāni. Pēc bāzes parametru noteikšanas mazā mērogā samaziniet drošu darba spiedienu ražošanas apjoma -palielināšanas laikā un rezervējiet atbilstošu procesa pielaides diapazonu.

2. Optimizējiet šķērsplūsmas ātrumu
Izveidojiet stabilu robežslāni un samaziniet koncentrācijas polarizāciju membrānas virsmā caur šķērsplūsmu, tādējādi samazinot olbaltumvielu uzkrāšanos uz membrānas virsmas avotā.

3. Ierobežojiet galīgo koncentrāciju pēc koncentrācijas
Nosakiet robežkoncentrāciju, pamatojoties uz proteīna fizikāli ķīmiskajām īpašībām, un izvairieties no pārmērīgas barības koncentrācijas. Attiecībā uz mAb parastā galīgā koncentrācija parasti nepārsniedz 50 mg/ml; dažiem mAb, kuriem ir tendence uz agregāciju{2}}, koncentrācija ir jāsamazina vēl vairāk.

4. Kontrolējiet barības pH un vadītspēju
Saglabājiet stabilu proteīna hidratēto daļiņu izmēru un izvairieties no molekulārās kontrakcijas, ko izraisa skābes/bāzes vai jonu stipruma traucējumi.

(B) Aprīkojums un darbības vadības ierīces

1. Pirms katras partijas veiciet membrānas kasetes integritātes pārbaudi
Pirms katras sērijas izgatavošanas veiciet burbuļu{0}}punkta pārbaudi, lai noteiktu plīsušās membrānas šķiedras. Bojātās membrānas kasetes nekavējoties jāiznīcina, lai novērstu nepārtrauktu olbaltumvielu noplūdi.

2. Standartizējiet CIP tīrīšanas procedūru
Kontrolējiet NaOH koncentrāciju un kontakta laiku. Pēc spēcīgas sārmainas tīrīšanas pilnībā līdzsvarojiet membrānas materiālu, lai samazinātu membrānas poru deformācijas risku.

3. Izmantojiet pakāpenisku diafiltrāciju
Agrīnā stadijā izmantojiet lielu -apjoma bufera apmaiņu, lai noņemtu sāļus, un, tuvojoties beigu punktam, palēniniet diafiltrācijas plūsmas ātrumu, lai samazinātu olbaltumvielu vilkšanu un zudumus.

 

III. Procesa projektēšanas telpas izveide, izmantojot DOE (QbD procesa raksturojums; piemērojams IND iesniegšanai)

1. Faktoru skrīnings
Ekrāna piecus galvenos UF/DF procesa parametrus (P): transmembrānas spiediens, padeves plūsmas ātrums, sākotnējā proteīna koncentrācija, barības pH un darba temperatūra.
Atbildes mainīgie: saglabātā raža, olbaltumvielu saturs permeātā, membrānas plūsma un augstas -molekulāras- masas agregātu procentuālais daudzums.

Izmantojot nozīmīguma analīzi, identificējiet galvenos faktorus, kas veicina olbaltumvielu noplūdi.

2. Atbildes virsmas modelēšana
Atlasiet četrus parametrus ar vislielāko nozīmi, lai izveidotu atbildes virsmu un analizētu parametru mijiedarbību. Daudzos darbības apstākļos viens parametrs var palikt noteiktajā diapazonā, savukārt divu parametru kombinācija var izraisīt olbaltumvielu caurlaidību. Šādus mijiedarbības efektus nevar noteikt, izmantojot tradicionālos eksperimentus ar vienu-faktoru-vienlaikus--. Pamatojoties uz modeli, definējiet darbināmu dizaina telpu. Kamēr procesa parametri paliek šajā diapazonā, var nodrošināt efektīvu olbaltumvielu aizturi, kamēr piemaisījumi tiek noņemti ar diafiltrāciju.

3. Sliktākā-gadījuma izaicinājums (nepieciešams procesa raksturošanai)
Atlasiet procesa parametrus darbības robežu galējās robežās, lai modelētu ražošanas mainīgumu: maksimālo TMP, minimālo šķērsplūsmas ātrumu un augšējo{0}}proteīna koncentrāciju. Pārbaudiet, vai pat ekstremālos darbības apstākļos nenotiek liela mēroga mērķa proteīna zudums, tādējādi izpildot CMC pārskatīšanas prasības.

 

IV. Vairākas analītiskās metodes, lai identificētu permeātā konstatētos proteīnus un atšķirtu mērķa mAb, sadalīšanās fragmentus un HCP

Pamatojoties uz analītisko efektivitāti, izmaksām un normatīvajiem iesniegšanas scenārijiem, metodes var iedalīt divās kategorijās: ātrā skrīnings un apstiprinošā pārbaude. Parastā procesa uzraudzībā prioritāte jāpiešķir ātrajām metodēm; Ja rodas patoloģiskas novirzes, jāizmanto precīzas identifikācijas metodes.

1. UV spektrofotometrija (ātrs tiešsaistes skrīnings; ieteicams veikt ikdienas veikalu{1}}grīdu uzraudzību)
Savāc permeātu un izmēra tā A280 absorbciju. Tas var tikai noteikt, vai permeātā ir olbaltumvielas, un nevar atšķirt olbaltumvielu sugas. To galvenokārt izmanto ikdienas procesu uzraudzībai. Nepārtraukti pieaugoša A280 vērtība norāda uz olbaltumvielu noplūdes pasliktināšanos un prasa tūlītēju diafiltrācijas apturēšanu un procesa izmeklēšanu.

2. SDS-PAGE elektroforēze (visbiežāk izmantotā kvalitatīvās identifikācijas metode)
Izmantojiet reducējošu un nereducējošu{0}}elektroforēzi un salīdziniet joslu pozīcijas ar mērķa mAb izejvielām:
1) Ja joslas pozīcija pilnībā atbilst mērķa mAb, neskarts mAb ir caurstrāvojis membrānu.
2) Ja parādās mazākas -molekulārās-svaras joslas, proteīns ir hidrolītiski šķelts, veidojot mAb fragmentus.
3) Ja joslas ir izkaisītas ar vairākām dažādām joslām, lielākā daļa ir saimniekšūnu proteīni (HCP) no E. coli/CHO saimniekšūnām, nevis mērķa produkts.

3. Augstas-efektivitātes izmēra-izslēgšanas hromatogrāfija (HPSEC)
Atdaliet komponentus pēc molekulārā izmēra un salīdziniet to eluēšanas laikus ar izejvielu hromatogrammas laikiem:
- Galvenais maksimums ar tādu pašu aiztures laiku kā mAb norāda uz neskartu mērķa proteīnu.
- Pīķis, kas eluējas agrāk, norāda uz augstas-molekulāras-masas agregātiem/fragmentiem.
- Pīķis, kas eluējas vēlāk, norāda uz zemas-molekulāras-svaras sadalīšanās fragmentiem.
- Raksturīga galvenā pīķa neesamība norāda uz HCP piemaisījumu proteīniem.
Šī metode var nodrošināt kvantitatīvus datus, un to var iekļaut procesa noviržu izmeklēšanas ziņojumos; tam ir augsta atzinība klīniskās iesniegšanas materiālos.

4. HCP saimniek-šūnu proteīna ELISA komplekta pārbaude
Ja permeātā tiek konstatēts proteīns, ELISA rezultāts ir paaugstināts un HPSEC neuzrāda raksturīgu mAb pīķi, noplūdušo materiālu pamatā var noteikt kā CHO saimniekšūnu{0}} proteīnus. Tas norāda uz nepilnīgu piemaisījumu noņemšanu iepriekšējās attīrīšanas laikā; piemaisījumi tiek izskaloti UF/DF posmā, un tie neatspoguļo produkta zudumus.

5. Afinitātes hromatogrāfijas pārbaude (A proteīna hromatogrāfija)
Proteīns A īpaši saistās ar mAb Fc reģionu. Ievietojiet permeāta paraugu kolonnā: raksturīga eluēšanas pīķa parādīšanās norāda uz neskartas mērķa antivielas klātbūtni; eluācijas pīķa neesamība parāda, ka visas permeātā esošās olbaltumvielas ir piemaisījumu proteīni.

6. Masas spektrometrija (LC-MS) (padziļināta izsekojamība; izmanto galveno procesa noviržu izmeklēšanai)
LC-MS var tieši analizēt aminoskābju secību un precīzi noteikt proteīna izcelsmi. To galvenokārt izmanto sarežģītu vai neparastu noviržu izmeklēšanai, un to neizmanto kā kārtējo -procesa kontroles testu.

V. Korektīvās darbības, kas atbilst dažādiem analītiskajiem rezultātiem

1. Permeātā konstatēts neskarts mērķa mAb
Samazināt transmembrānas spiedienu un galīgo koncentrāciju pēc koncentrācijas; sašaurināt procesa darbības diapazonu, pamatojoties uz DOE rezultātiem; un pārbaudiet membrānas kasetes integritāti.

2. Permeātā konstatēti antivielu noārdīšanās fragmenti
Izpētīt bīdes spriegumu visā procesā un pH galējās vērtības; optimizēt augšupējo vīrusu inaktivācijas soli, lai samazinātu olbaltumvielu šķelšanos.

3. Permeātā konstatēti tikai HCP piemaisījumu proteīni
UF/DF parametru pielāgošana nav nepieciešama. Izsekojiet problēmai līdz iepriekšējām hromatogrāfijas darbībām un uzlabojiet piemaisījumu noņemšanu afinitātes un jonu apmaiņas -hromatogrāfijas laikā.

 

VI. Kopsavilkums

Lai novērstu proteīnu noplūdi UF/DF laikā, tradicionālā procesa kontrole balstās uz vēsturisko pieredzi, lai definētu atsevišķus punktu parametrus, kas var adekvāti risināt tikai stabilu maza apjoma ražošanu. Lai nodrošinātu stabilu veiktspēju pakāpeniskas procesa -paaugstināšanas laikā, ir jāizmanto DOE-balstīts procesa raksturojums, lai izveidotu procesa plānošanas telpu ar pietiekamu pielaidi. Intervālu-balstīta parametru vadība var kompensēt ražošanas mainīgumu. Kad olbaltumvielas ir konstatētas permeātā, vienkārša UV noteikšanas sistēma var sniegt sākotnējo brīdinājumu, kam seko elektroforēze, HPSEC un ELISA izsekojamībai un identificēšanai. Tas ļauj precīzi atšķirt mērķa produktu un saimniekšūnu-piemaisījumus, ļaujot mērķtiecīgi izpētīt saknes-cēloņus un veikt koriģējošas darbības. Tas ir arī standartizēts pētniecības komponents, kas pašlaik ir iekļauts CMC dokumentācijā mAb projektiem.