Ultrafiltrācijas pielietojums dabiskā kolagēna ekstrakcijā

Kolagēnam kā dabiskam olbaltumvielu resursam ir laba bioloģiskā saderība, zema antigenitāte, bionoārdīšanās un hemostāze, tā ciešā spirālveida struktūra un savas īpašības, kas nodrošina priekšnoteikumus tā industrializācijai. Kolagēns un tā blakusprodukti tiek izmantoti ne tikai kā iepakojuma materiāli, kosmētika un veselības aprūpes produkti, bet arī kā pārtikas piedevas gaļas produktu uzlabošanai, un tam ir liela nozīme, īpaši medicīnas jomā.

 

Kas ir kolagēns?

 

Kolagēns ir bioloģiska makromolekula, galvenā dzīvnieku saistaudu sastāvdaļa un visizplatītākā un izplatītākā funkcionālā olbaltumviela zīdītājiem, kas veido 25% līdz 30% no kopējā olbaltumvielu daudzuma un dažos organismos pat līdz 80% vai vairāk. Tas spēlē saistaudi dzīvnieku šūnās.

Izmērīts, ka pieauguša cilvēka organismā ir aptuveni 3 kg kolagēna, kas galvenokārt atrodas cilvēka ādā, kaulos, acīs, zobos, cīpslās, iekšējos orgānos (tai skaitā sirdī, kuņģī, zarnās, asinsvados) un citās cilvēka ķermeņa daļās, funkcija ir saglabāt ādas un audu un orgānu morfoloģiju un struktūru, kā arī tas ir svarīgs izejmateriāls dažādu audu atjaunošanai pēc traumām.

 

Ir daudz kolagēna proteīna veidu, un izplatītākie ir I tips, II tips, III tips, V un XI tips. Labās bioloģiskās saderības, bioloģiskās noārdīšanās un bioaktivitātes dēļ kolagēns ir plaši izmantots pārtikā, medicīnā, audu inženierijā, kosmētikā un citās jomās.

Kā iegūt dabisko kolagēnu

Dzīvnieku audi no mājlopiem un mājputniem ir galvenais veids, kā cilvēki var iegūt dabisko kolagēnu un tā kolagēna peptīdus. Tomēr saistīto dzīvnieku slimību un noteiktu reliģisko uzskatu dēļ cilvēki kolagēnu un tā produktus no sauszemes zīdītājiem izmanto ierobežoti, un attīstība pakāpeniski pievēršas jūras organismiem. Eiropas Pārtikas nekaitīguma iestāde (EFSA) ir apstiprinājusi, ka pat kolagēns, kas iegūts no dzīvnieku kauliem, nevar inficēt govju trakuma slimību un citas ar to saistītas slimības. Aminoskābju sastāva un šķērssaistīšanas pakāpes atšķirību dēļ ūdensdzīvniekiem, jo ​​īpaši kolagēnam, kas bagāts ar to pārstrādes atkritumiem, piemēram, ādu, kauliem un zvīņām, ir daudz priekšrocību, kas nav mājlopu kolagēnam. Turklāt no jūras dzīvniekiem iegūtais kolagēns dažos aspektos, piemēram, ar zemu antigenitāti un hipoalerģiskumu, acīmredzami ir pārāks par kolagēnu no sauszemes dzīvniekiem. Tāpēc ūdens kolagēns var pakāpeniski aizstāt sauszemes dzīvnieku kolagēnu. Par piemēru tika ņemts kolagēna iegūšanas process no amūra zivju zvīņām.

 

Kolagēna iegūšana no amūra zivju zvīņām ar ultrafiltrācijas metodi

1. Materiāli un metodes

1.1 Testa paraugs

Neapstrādāts kolagēna ūdens ekstrakts.

1.2. Pārbaudes metodes

1.2.1. Ultrafiltrācijas procesa ceļš

 

1.2.2. Pirmsfiltrācijas procesa noteikšana

Šajā testā vakuuma filtrēšanas metode un mikrofiltrācijas metode tiek salīdzināta un analizēta, lai noteiktu labāko pirmsfiltrācijas filtrēšanas procesu. Īpašās pārbaudes metodes ir šādas:

① Neapstrādāts kolagēna ūdens ekstrakts tika filtrēts, sūknējot filtrpapīru ar vakuumu, lai ūdens ekstraktā noņemtu suspendētās daļiņas un piemaisījumus.

② Neapstrādāts kolagēna ūdens ekstrakts tika filtrēts ar 0,2 μm mikrofiltrācijas membrānu, lai ūdens ekstraktā noņemtu nešķīstošās vielas un piemaisījumus.

 

1.2.3. Ultrafiltrācijas membrānas poru izmēra izvēle

Ultrafiltrācijas membrānas poru izmērs bija 100 kDa.

 

1.2.4 Ultrafiltrācijas attīrīšanas procesa viena faktora eksperiments

Neapstrādāta kolagēna ūdens ekstrakta attīrīšanai tika izmantota ultrafiltrācijas tehnoloģija, tika pētīti viena faktora eksperimenti par darba spiediena, darba temperatūras un pH vērtības ietekmi uz kolagēna aizturi. Pēc ultrafiltrācijas iekārtas iedarbināšanas uz laiku un stabilizēšanās tika pētīta dažādu faktoru ietekme uz kolagēna aizturi.

 

1.2.5. Aprēķinu formula

 

2. Rezultāti un analīze

2.1. Pirmsfiltrācijas procesa analīzes rezultāti

Abu vakuuma ekstrakcijas un mikrofiltrācijas filtrēšanas metožu salīdzināšanas rezultāti ir parādīti nākamajā tabulā.

 

Tabulā redzams, ka gan vakuumfiltrācijas metode, gan mikrofiltrācijas metode var noņemt šķīdumā esošos piemaisījumus un nešķīstošās cietās vielas, bet mikrofiltrācijas metodei ir labāka proteīnu aizsargājoša iedarbība, tas ir, zudumi nav acīmredzami, un vakuumfiltrācijas metode ir viegli izraisīt olbaltumvielu zudumu. Turklāt, izmantojot vakuuma filtrēšanas metodi, pēc filtrāta ievietošanas kādu laiku parādās duļķainība, un mikrofiltrāts joprojām ir dzidrs un caurspīdīgs, tāpēc mikrofiltrācija tiek izvēlēta kā ultrafiltrācijas priekšapstrādes process.

 

2.2 Ultrafiltrācijas procesa viena faktora pārbaude

2.2.1. Ultrafiltrācijas spiediena ietekme uz aiztures ātrumu

Pie temperatūras 40 grādiem un pH=9.0 dažādu ultrafiltrācijas spiedienu ietekme (0.07MPa, {{9} }.09MPa, 0,11MPa, 0,13MPa un 0,15MPa) tika pētīta olbaltumvielu aizturi. Rezultāti ir parādīti zemāk esošajā attēlā.

Kā redzams iepriekš attēlā, palielinoties darba spiedienam, olbaltumvielu aiztures ātrums pakāpeniski samazinās. Ja darba spiediens ir {{0}}.07 MPa, olbaltumvielu aiztures līmenis ir 96,53%, un, ja darba spiediens ir 0,15 MPa, olbaltumvielu aiztures līmenis ir 84,38%. Tas ir tāpēc, ka ultrafiltrācijas atdalīšanas efektu uz vielām veic spiediena starpība. Zema darba spiediena diapazonā mazas molekulas var ātri iziet cauri membrānai, savukārt lielas molekulas var tikt notvertas ar ultrafiltrācijas membrānu un uzkrāties uz membrānas virsmas. Šajā laikā membrānas virsma un ūdens ekstrakts veido koncentrācijas atšķirību, kā rezultātā rodas koncentrācijas polarizācijas pretestība. Šobrīd spiediens ir salīdzinoši zems, un tas nevar būtiski ietekmēt aiztures līmeni. Tomēr, palielinoties spiedienam, koncentrācijas polarizācijas pretestība pakāpeniski palielinās, un koncentrācijas starpība starp membrānas virsmu un ūdens ekstraktu sasniedz līdzsvaru. Kad spiediens pārsniedz šo līdzsvaru, uz membrānas virsmas var veidoties gēla slānis (kas atbilst teorijai, ka ultrafiltrācijas laikā veidojas koncentrācijas polarizācija un kondensācijas slānis), un spiediens turpina pieaugt, palielinās gēla slāņa biezums. , un palielinās arī proteīnu daudzums, kas paliek uz membrānas virsmas. Tas rada zemāku aiztures līmeni. Lai nodrošinātu membrānas atdalīšanas efektu, optimālais darba spiediena parametrs ir 0,07 MPa.

 

2.2.2. Temperatūras ietekme uz olbaltumvielu aizturi

Apstākļos, kad spiediens ir {{0}},11 MPa un pH=9,0, dažādu temperatūru, proti, 25 grādi , 30 grādi , 35 grādi , 40 grādi un 45 grādi , ietekme uz olbaltumvielām tika pētīta saglabāšana. Rezultāti ir parādīti zemāk esošajā attēlā.

Kā redzams no attēla, ultrafiltrācijas membrānas aiztures ātrums pakāpeniski palielinās, paaugstinoties temperatūrai, un sasniedz maksimumu pie 45 grādiem ar aiztures koeficientu 97,01%. Tas ir tāpēc, ka kolagēna viskozitāte ir cieši saistīta ar temperatūru. Ja temperatūra ir zema, kolagēna viskozitāte ir lielāka, un kolagēna uzkrāšanās uz membrānas virsmas viegli veido pretestību, kā rezultātā ir zems aiztures līmenis. Paaugstinoties temperatūrai, samazinās kolagēna viskozitāte, pavājinās mijiedarbība starp kolagēna molekulām un palielinās masas pārneses ātrums, pavājinās koncentrācijas polarizācijas parādība un palielinās aiztures ātrums. Vēl viens iemesls aiztures ātruma palielināšanai ir tas, ka paaugstinās temperatūra, attiecīgi palielinās arī kolagēna šķīdība, kā arī samazinās kolagēna parādība, kas bloķē membrānu, tāpēc optimālā ultrafiltrācijas temperatūra ir 45 grādi.

 

2.2.3. pH vērtības ietekme uz olbaltumvielu aizturi

Apstākļos {{0}},11 MPa spiediena un 40 grādu temperatūras ietekmē dažādu pH apstākļu, proti, pH=6.0, pH{{ 5}}.{{10}}, pH=8,0, pH=9,0 un pH=10,0, par aiztures ātrumu. Rezultāti ir parādīti zemāk esošajā attēlā.

 

As can be seen from the figure above, in the range of pH 6-7, the protein retention rate decreases with the increase of pH value, and the minimum value is 82.13% when pH=7.0; when pH>7, the retention rate gradually increases with the increase of pH value. This is because the isoelectric point of collagen is pH=7. At the isoelectric point, the protein is in a state of precipitation, which is easy to stay on the surface of the membrane and block the membrane, thus reducing the retention rate. When pH>7, aiztures ātrums pakāpeniski palielinās, palielinoties pH vērtībai. Tas ir tāpēc, ka ultrafiltrācijas membrāna ir poliētera kļavas membrāna ar negatīvu lādiņu, un kolagēns ir negatīvi uzlādēts sārmainos apstākļos. Negatīvi lādētās kolagēna molekulas veido savstarpēji izslēdzošu stāvokli ar ultrafiltrācijas membrānu ar vienādu lādiņu, līdz ar to kolagēna molekulām nav viegli noturēties uz membrānas virsmas un bloķēt membrānu. Tāpēc ultrafiltrācijas optimālā pH vērtība ir 8-10.

 

2.3 Ultrafiltrācijas procesa optimizācija un rezultātu pārbaude

Saskaņā ar programmatūras Design-Expert8.05 analīzi optimālie procesa parametri ir: darba spiediens 0,14 MPa, darba temperatūra 40,98 grādi, šķīduma pH{{7 }}.43, un saglabāšanas rādītājs ir 92,551%. Ņemot vērā faktisko parametru darbspēju, ultrafiltrācijas apstākļi tika izvēlēti kā 0,14 MPa darba spiediens, 40 grādu darba temperatūra un materiāla šķīduma pH vērtība 9,50, un testa pārbaude tika uzsākta pēc ultrafiltrācijas sistēmas iedarbināšanas un stabilizēšanas. Saglabāšanas rādītāja rezultāts bija (92,61±0,1) % (n=3). Vienādojuma prognozētās vērtības būtībā ir līdzīgas izmērītajām vērtībām, kas parāda, ka prognozētie stāvokļa parametru rezultāti saskan ar faktiskajiem stāvokļa rezultātiem.

 

2.4 Elektroforētiskās analīzes rezultāti

Attīrītais kolagēns tika analizēts ar SDS-PAGE elektroforēzi, un rezultāti ir parādīti nākamajā attēlā.

 

Kā redzams no attēla, 1. josla ir šī testa attīrītais kolagēns, bet 2. josla ir teļa cīpslas standarta kolagēna paraugs. No SDS-PAGE elektroforēzes var redzēt, ka šajā pētījumā kolagēnu var identificēt kā kolagēnu, taču šķiet, ka robežas starp a1 peptīdu ķēdi un a2 peptīdu ķēdi nav skaidras. No elektroforēzes kartes var redzēt, ka citu olbaltumvielu piemaisījumu nav, tāpēc var secināt, ka attīrītajam kolagēnam ir augsta tīrība.

Par Guidlingu

 

Guidling Technology ir nacionāls augsto tehnoloģiju uzņēmums, kas koncentrējas uz biofarmaceitiku, šūnu kultūru, biomedicīnas attīrīšanu un koncentrēšanu, diagnostiku un rūpnieciskajiem šķidrumiem. Mēs esam veiksmīgi izstrādājuši centrbēdzes filtru ierīces, ultrafiltrācijas un mikrofiltrācijas kasetes, vīrusu filtru, TFF sistēmu, dziļuma filtru, dobu šķiedru utt., kas pilnībā atbilst biofarmaceitisko līdzekļu, šūnu kultūras un tā tālāk pielietojuma scenārijiem. Mūsu membrānas un membrānfiltrus plaši izmanto priekšfiltrācijas, mikrofiltrācijas, ultrafiltrācijas un nanofiltrācijas koncentrēšanai, ekstrakcijai un atdalīšanai. Mūsu daudzās produktu līnijas, sākot no mazas vienreizējas lietošanas laboratorijas filtrēšanas līdz ražošanas filtrēšanas sistēmām, sterilitātes pārbaudei, fermentācijai, šūnu kultūrai un citiem, atbilst testēšanas un ražošanas vajadzībām. Guidling Technology cer ar jums sadarboties!