Membrānas tehnoloģija un vakcīnu precizēšana (Ⅱ)

Iepriekšējā rakstā mums bija neliels ievads par vakcīnām un vakcīnu precizēšanas stratēģijām, un mēs turpināsim tos izpētīt šī raksta pārējā daļā. Turpinot iepriekš minēto, mēs turpināsim dalīties ar precizējumiem par vakcīnām un saistītajiem membrānas audu lietojumiem.

 

2.2.2. Vīrusa fizikālo un ķīmisko īpašību ietekme

Pēc ražošanas sistēmas un metožu apsvēršanas attiecīgo piesārņotāju noņemšanai dzidrināšanas posmā ir svarīgi ņemt vērā vīrusa īpašības un koncentrēties uz vīrusa iznākuma maksimālu palielināšanu.

 

2.2.2.1. Viegla vīrusu adsorbcija
Lai uzlabotu dziļās filtrēšanas efektus, ir izstrādāti pozitīvi uzlādēti materiāli un filtrēšanas palīglīdzekļi (piemēram, diatomīts). Lai gan pozitīvais lādiņš palielina nukleīnskābju un HCP uztveršanu, ir zināms, ka diatomīts saista šūnu atliekas un koloīdus. Tomēr šie materiāli var arī saglabāt vīrusu, izmantojot adsorbcijas mehānismu. Tā kā vīruss šķīdumā parasti ir negatīvi uzlādēts, var rasties elektrostatiskā mijiedarbība ar pozitīvi lādētu filtru.
Vīrusi var arī saistīties ar to hidrofobām vai nespecifiskām mijiedarbībām ar noteiktiem filtru materiāliem (piemēram, diatomītu vai stikla šķiedrām). Apvalkotie vīrusi to lipīdu apvalka dēļ ir jutīgāki pret šo adsorbciju. Ja vīruss tiek adsorbēts filtrā, izmantojot elektrostatisku mijiedarbību, un vīrusa daļiņas tiek atdalītas sāls konkurences dēļ, filtra skalošana ar augstas vadītspējas buferi var daļēji atgūt vīrusu. Tomēr tas var arī eluēt piesārņotājus, piemēram, HCP vai nukleīnskābes. Tāpēc priekšroka dodama alternatīvam filtra materiālam, piemēram, inertam polipropilēnam.
Adenovirus is easily adsorbed, but different results have been confirmed. Using positively charged diatomite and deep filters. Borosilicate glass fiber filter material is also very well recovered. On the other hand, a patent proposed by Weggeman involving clarification of 20 – 40% adenovirus losses at PER, et al. Cell cultures were prepared with similarly positively charged deep filters containing diatomite. In this case, the nominal polypropylene filter showed a very high viral recovery rate (> 90%).
Ir labi zināms, ka dzidrināšanas laikā gripas vīrusi ir pakļauti adsorbcijas zudumam. Tāpēc bezuzlādes filtra, uz polipropilēna bāzes, izmantošana ir piemērota gripas kolekcijas noskaidrošanai. Thompson et al ziņoja, ka tika izmantots nominālais 1,2 μm polipropilēna filtrs, kam seko 0,45 μm PVDF membrāna, lai noskaidrotu uz šūnām balstītu gripas vīrusu, ko ražo MDCK šūnas. Kopumā tika veikti deviņi attīrīšanas testi 20L mērogā, slodze 111 l/m2 1,2 μm polipropilēna filtram un 105 l/m2 0,45 μm PVDF filtram. Rezultāti parādīja, ka lielākā daļa darbojošos vīrusu atveseļojās labi (78-154%). Viņi arī ziņoja par hcDNS izņemšanu līdz 58%, bet ne nozīmīgu HCP izņemšanu.

 

2.2.2.2. Sensitīvu vīrusu apgriešana

Dažiem vīrusiem (iekapsulētiem vai neiekapsulētiem) ir zema mehāniskā pretestība, un tos var iznīcināt bīdes iedarbības centrifugēšanas un membrānas filtrēšanas laikā. Bīdes spēki, kas rodas attīrīšanas posmos, kas ietver filtrēšanu vai hromatogrāfiju, var izraisīt vīrusa apvalka nokrišanu, tādējādi ietekmējot inficētspēju. Atkarībā no kapsīda izmēra, biezuma un ģeometrijas vīrusa kapsīds var būt trausls vai, gluži pretēji, noturīgs pret augstu spiedienu. Daži apvalkoti vīrusi, piemēram, gripas vīrusi, ir elastīgi pret mehānisko spriegumu un var izturēt lielas deformācijas. No otras puses, bīdes spēks var izraisīt mazāk rezistentu vīrusu, piemēram, retrovīrusu, apvalka nokrišanu, tādējādi ietekmējot vīrusa inficētspēju.

Āršūnu ģenerētie aploksnes VLP arī ir ļoti neaizsargāti. Lieli bīdes ātrumi rodas centrbēdzes procesā, galvenokārt ieplūdes un izplūdes daļās (augsti bīdes ātrumi rodas gāzes un šķidruma saskarnē). Kad vīruss tika attīrīts ar gradienta centrifugēšanu, dažu retrovīrusu transdukcijas spēja tika ievērojami vājināta. Izstrādājot centrbēdzes atdalīšanu, jāņem vērā vīrusa daļiņu relatīvā nestabilitāte pret bīdes spēkiem. Centrbēdzes spēks nav vienīgais bīdes trieciena avots, svarīgāks ir aprīkojuma dizains, jo īpaši importa un eksporta gadījumā ir arī ievērojams bīdes trieciens. Atšķirības dažādu mērogu dizainā var izraisīt atšķirības pret bīdes jutīgu vīrusu ražu un atveseļošanos dažādos mērogos.

Bīdes jutīgie vīrusi ir rūpīgi jāizstrādā, jo bīdes sprieguma lielums un sprieguma iedarbības laiks (recirkulācijas dēļ) var būt augsts. Bīdes jutīgiem vīrusiem priekšroka dodama atvērtas ķēdes ierīcēm (dobu šķiedru vai atvērtu plākšņu ierīcēm), lai samazinātu turbulenci un bīdes spēkus padeves kanālā.

Darbības parametru izvēlei arī jāsamazina vīrusa daļiņu bojājumi: zema šķērsplūsma, vidējs transmembrānas spiediens (TMP) un īss apstrādes laiks.

Membrānas piesārņojums zem augsta spiediena izraisa vīrusa infekciozitātes zudumu, iespējams, to spēku dēļ, kas bīdes darbība var iedarboties uz vīrusa apvalku. Membrānas atdalīšanas pamatā ir izmērs, un lielas molekulmasas vīrusu inhibitoru un vīrusu daļiņu uzkrāšanās var samazināt vīrusu vektoru inficētspēju.

Bīdes jutīgo vīrusu noārdīšanās dziļās filtrēšanas laikā nav plaši dokumentēta. Vīrusu zudums dziļajā filtrācijā visbiežāk ir saistīts ar slazdošanu, adsorbciju vai produkta laika un temperatūras atkarīgu vīrusu noārdīšanos. Faktiski, lai gan NFF sistēmās var rasties mehānisks spriegums, NFF izstrādājumu bīdes iedarbības laiks ir ļoti īss, salīdzinot ar citām tehnoloģijām, jo ​​NFF izstrādājumiem ir raksturīga ātra vienreizēja pāreja.

 

2.2.2.3. Pārtveršana atbilstoši apertūras izmēram

Vīrusus, kuru garums pārsniedz 100 nm, var noturēt, noņemot mikoplazmas vai sterilas pakāpes membrānas (0,22 μm un zemākas). Šajā gadījumā īpaša uzmanība jāpievērš filtru izvēlei. Mikrofiltrācijas TFF posmiem priekšroka tiek dota 0,45 μm vai 0,65 μm membrānām labiem produktu kanāliem. NFF daudzpakāpju filtrēšanai blīvākais slānis ir lielāks par 0,45 μm vai vienāds ar to. Izvēloties dziļo filtru, jābūt uzmanīgiem, jo ​​dažās dziļā filtra ierīcēs var būt plēves slānis, kas var izraisīt produkta zudumu aiztures dēļ. Vīrusu agregācija negatīvi ietekmē vīrusa ražošanu un palielina vīrusa aizturi vīrusa lieluma dēļ.

Saskaņā ar Andre un Champluvier patentu homogenizācija var novērst vai ierobežot filtra aizsērēšanu, samazinot pildvielas izmēru, nodrošinot lielāku ražu. Homogenizācija uzlaboja arī ražas filtrēšanas jaudu, kas palielinājās 24-3 reizes.

Pārāk daudz piemaisījumu var traucēt vīrusa atveseļošanos. Piemaisījumi mēdz aizsprostot filtru, un aizsprostotas membrānas poras var samazināt vīrusa caurlaidības ātrumu. De Vocht un Veenstra patentā minēts, ka tieša augsta šūnu blīvuma Per. Savākšana ar TFF ({{0}}.65 vai 0.2 μm membrāna) izraisīja vīrusa atkopšanu bez adenovīrusa. Atgūšanu var panākt, selektīvi nogulsnējot saimniekšūnu DNS pirms 0,65 μm TFF soļa. 70% adenovīrusu.

 

 

2.3. Gadījuma izpēte: vīrusu vakcīnas precizēšanas optimizācija

2011. gada Starptautiskajā konferencē par bioloģiskajiem procesiem Sanofi Pasteur iepazīstināja ar racionālu pieeju filtru skrīningam, lai izstrādātu jaunas precizētas sekvences pretvīrusu vakcīnu kandidātiem. Pētījuma mērķis ir pārvarēt problēmas, ar kurām jāsaskaras, optimizējot šūnu un vīrusu kultūras procesus. Iepriekšējā procesa modifikācijas izraisīja 20% ražas zudumu un priekšlaicīgu filtra piesārņojumu dzidrināšanas posmā, kā rezultātā netika palielināts mērogs. Lai izveidotu stabilu un mērogojamu dzidrināšanas soli, bija nepieciešama pilnīga filtra secības atkārtota izstrāde ar vīrusu atkopšanas līmeni, kas pārsniedz 85%.

Based on internal experience and scientific publications, the team selected 27 filters for an initial screening study. Small scale virus adsorption tests were performed on various filter media (polypropylene, nylon, cellulose ester, glass fiber, charged adsorption filter) and structures (pleated or deep filter). The virus yield was measured by ELISA and the clarifying efficiency of the preselected filtrate was compared by checking the reduction of turbidity. Preliminary screening studies showed that nylon and charged filters retained viral particles and virus recovery. Ten percent. The virus recovery rate of polypropylene and polyether sulfone filter was >. 80%. Celulozes estera un stikla šķiedras filtru atgūšanas ātrums ir atkarīgs no filtra novērtējuma (20% vai 90%).

Kā otro soli Sanofi Pasteur novērtēja vairākas skrīninga pētījumā iepriekš atlasīto septiņu filtru kombinācijas (2. vai 3. fāzes secības). Pastāvīgās plūsmas klasifikācijas tests tika veikts ar nelielu filtru. Turklāt šajā eksperimentā tika izmantota lielāka raža nekā skrīninga pētījumā. Pamatojoties uz vīrusu atveseļošanās un filtra jaudas rezultātiem, komanda turpmākai izpētei izvēlējās divas labākās kombinācijas.

- 1. secība (2. posms): 30 μm nominālais salocīts polipropilēna priekšfiltrs, kam seko salikts celulozes estera un stikla šķiedras daudzslāņu filtrs (porainība 1/0,5 μm)

- 2. secība (3. posms): tas pats priekšfiltrs (30 μm nominālais polipropilēna filtrs), kam seko starpposma daudzslāņu polipropilēna filtrs un visbeidzot asimetriskā poliētera sulfona plēve.

 

The robustness of these two clarified sequences has been challenged by repeated constant flow sizing experiments with different harvest batches. While both potential sequences demonstrated enhanced capabilities compared to the reference sequence, only sequence 1 achieved virus recovery objectives (>85%), kā parādīts 1. attēlā.

1. attēls Vidējā vīrusa atkopšana katrā filtrēšanas posmā. Stabilitātes pētījumi tika novērtēti trim filtrēšanas sekvencēm, no kurām tikai 1. secība, izmantojot 30 μm nominālo salocītu polipropilēnu un 10/0,5 μm celulozes esteri un stikla šķiedras filtru, sasniedza vispārējo reģenerācijas mērķi. .

Centrifugēšana tika novērtēta arī kā primārais dzidrināšanas posms, kam sekoja {{0}},45 μm galīgā filtrēšana. Tika pārbaudīti vairāki ātruma/ilguma pāri. Lai gan filtrēšanas ātrums 0,45 μm tika palielināts divas reizes, galīgā iznākums bija mazāks par mērķi 85%. Rezultātā centrifugēšana tālāk nav pētīta.

Visbeidzot, polipropilēna un stikla šķiedras filtrēšanas secību veiktspēja tika novērtēta lielākā mērogā (160 L bioreaktora izmērs). Filtru secība ir parādīta 2. attēlā.

2. attēlā ir precizēta filtru kombinācija un virknes soļu iznākuma grafiskais attēlojums. Vilciens A ir tradicionāls process, un vilciens B ir optimizēts process. Optimizētā secība B var samazināt pirmsfiltrēšanas laukumu 3 reizes, atcelt starpposma filtrēšanas posmu un samazināt galīgo filtrēšanas laukumu 10 reizes, tādējādi palielinot globālo vīrusa atkopšanu par 3%.

Vairākas partijas tika veiksmīgi notīrītas bez filtra aizsprostošanās pazīmēm, procesa ilgums atbilst ražošanas ierobežojumiem un vīrusu iznākums > astoņdesmit pieci procenti. Skaidrības posma optimizācija neietekmēja pakārtotos posmus un galvenos vakcīnas kvalitātes atribūtus. Līdz ar to izvēlētā dzidrināšanas secība tika izmantota vakcīnas ražošanas procesā (1000 L izmēra bioreaktors) un darbība tika veiksmīgi apstiprināta.

 

03 Baktēriju vakcīnu precizēšana

3.1. Apsvērumi baktēriju vakcīnu precizēšanai

Saskaņā ar Medicīnas tēzauru (2015) baktēriju vakcīna ir definēta kā atšķaidītu vai nogalinātu baktēriju vai to antigēnu atvasinājumu suspensija, ko izmanto, lai izraisītu imūnreakciju, lai novērstu vai ārstētu bakteriālas slimības. Vispārīgāk, baktēriju vakcīnas var iedalīt četrās apakškategorijās, pamatojoties uz aktīvā antigēna veidu. Šis aģents var būt:

- Nogalina vai novājina visas dzīvās baktērijas. Pazīstama arī kā BCG vakcīna.

- Antigēnu determinantu attīrīšana (apakšvienību vakcīnas). Vakcīna pret Sibīrijas mēri vai acelulārā garā klepus vakcīna.

- Baktēriju toksīni (toksoīdi). Difterijas un stingumkrampju toksoīdi.

- Plazmīda (pDNS).

Sakarā ar saimes produktu plašo neviendabīgumu, iepriekšējā un pakārtotā procesa izaicinājumi lielā mērā ir atkarīgi no ražotās vakcīnas veida. Tāpēc pēc sākotnējās fermentācijas posma var attīrīt vai neattīrīt, lai varētu veikt dzidrināšanas posmu.

 

3.2. Baktēriju vakcīnas precizēšanas stratēģija

3.2.1. Toksoīds

Divi visizplatītākie toksoīdi, ko ražo vakcīnu lietošanai, ir difterija un stingumkrampji, kurus ražo attiecīgi Corynebacterium diphtheriae un Clostridium tetani. Abu vakcīnu ražošana ir pakļauta stingrām normatīvajām prasībām. PVO tehniskajā ziņojumā un tā pielikumos ir sniegti skaidri ieteikumi, lai nodrošinātu stingumkrampju un difterijas vakcīnu kvalitāti, drošību un efektivitāti. Vispārīgā labā ražošanas prakse attiecas uz abu vakcīnu ražošanu, un darbiniekiem ir jābūt atbilstoši apmācītiem un jāsaņem revakcinācija pret abām slimībām.

LRP stingri nosaka, ka ir jāpierāda galaprodukta tīrība un kvalitāte. Saskaņā ar PVO un EP galīgās stingumkrampju vakcīnas efektivitāte ir jānosaka, salīdzinot in vivo vai ar jebkuru citu pārbaudītu metodi ar atbilstošu standartvielu, kas kalibrēta starptautiskās vienībās saskaņā ar Starptautisko stingumkrampju toksoīda standartu. Atjauninātās efektivitātes prasības tika publicētas 2011. gadā, un tās var atšķirties atkarībā no novērtēšanas metodes. Jāpierāda arī katras vakcīnas sērijas drošība (bez toksīniem un atjaunojoša toksicitāte). Visbeidzot, ir jāpievēršas vakcīnu stabilitātei, jo īpaši reālajā laikā.

 

3.2.2. Plazmīdu DNS vakcīna

Plazmīdu DNS vakcīnas tiek izmantotas dzīvnieku veselības nolūkos, un vairākas cilvēkiem paredzētās plazmīdu DNS vakcīnas atrodas dažādās izstrādes un klīniskās novērtēšanas stadijās. Pēc E. coli fermentācijas baktērijas tiek savāktas un sadalītas, lai atbrīvotu plazmīdu DNS.

Šūnu atlieku noņemšanu parasti veic, centrifugējot vai filtrējot. Šī tēma ir plaši aplūkota jaunākajās publikācijās. Šajā publikācijā pašreizējie augšupējie, pakārtotie un formulēšanas pDNS procesi un izaicinājumi.

Autori arī sniedz ieskatu par nepilnībām katrā tipiskā pDNS ražošanas procesa posmā un potenciālajiem nākotnes jauninājumiem un/vai pašreizējām tehnoloģiju nepilnībām, kas varētu novest pie turpmākas procesa optimizācijas.

Plazmīdu DNS vakcīnas sagatavo divos posmos. Pirmkārt, baktēriju šūnas tiek izņemtas no barotnes un, otrkārt, pēc šūnu līzes tiek noņemtas šūnu atliekas. Atkarībā no mēroga šūnas savāc, izmantojot centrifugēšanu vai TFF mikrofiltrāciju. Diska kaudzes centrifūga tiek periodiski izspiesta lielā ātrumā, un superspirālveida plazmīdu iznākums ir zems, jo izlādes laikā rodas bīdes bojājumi. Ja jāizmanto centrifugēšana, vislabāk ir izmantot cieto trauku centrifūgu. Labi var darboties atvērta kanāla plakanas TFF ierīces ar 0,1 vai 0,2 μm mikrofiltrācijas membrānām vai dobu šķiedru ierīcēm.

Tā kā dobu šķiedru ierīcēm ir liela cietās slodzes jauda, ​​tām dažreiz tiek piešķirta prioritāte. Parasti šie procesi darbojas 3-5 reizes lielāku koncentrāciju, kam seko 3-5 transfiltrācijas tilpumi. Lai samazinātu bīdi un labāk kontrolētu membrānas polarizāciju, ļoti ieteicamas iespiešanās kontroles darbības. Lai gan centrifūgas ir rentablākas liela mēroga komerciālās darbībās, mazāka mēroga procesos parasti tiek izmantota filtrēšana pārnesamības un ērtas darbības dēļ.

Apstrādes atvieglošanai ir izmantoti flokulanti, taču tas var izraisīt produkta zudumus. Daži arī iesaka izmantot inertas diatomīta zemes daļiņas, kam seko maisa filtrēšana.

Cell lysis produces viscous products, including large particles, cell fragments, soluble impurities, fine colloidal particles, and pDNA. Due to the complexity of the material, removing such fine solids is a difficult separation. Gradient density deep filter or open hole structure (>0,45 m) membrānas filtri labi noņem šūnu atliekas. Sakarā ar spēcīgu šūnu atlieku aizsērēšanu, priekšroka tiek dota zemas plūsmas vai zema spiediena filtrēšanai. Šim solim ir izmantoti Tff bāzes mikrofiltri un rūpnieciska mēroga maisu filtri. Statiskajai (maisīšanas traukā) un nepārtrauktai (izmantojot iebūvēto statisko maisītāju) plaisāšanai nepieciešami dažādi filtri.

 

3.3. Gadījuma izpēte: centrifugēšanas, NFF un TFF metožu efektivitātes salīdzinājums stingumkrampju toksīnu attīrīšanai

Muniandi et al. salīdzināja trīs dažādas metodes stingumkrampju toksīnu un toksoīdu attīrīšanai no fermentācijas šķidrumiem, proti, centrifugēšanu, dziļo filtrēšanu (NFF) un TFF. Pārbaudāmais materiāls tika ražots 400L fermentatorā, izmantojot modificētu Millera (MMM) barotni. Centrifugēšanas pētījumā šūnas tika atdalītas no sirds ar ātrumu 4000 RPM 6 × 1 l traukā 60 minūtes. Tika ņemti supernatanta paraugi, lai noteiktu toksoīdu atjaunošanos. Dziļā filtrācijā fermentācijas buljona dzidrināšanai izmanto 0,45 μm un 0,22 μm dziļus filtrus, kas satur diatomītu un celulozi. Process tiek veikts 35 grādu temperatūrā un 12psi.

Atvērts plakana paneļa TFF modulis ir termiski saistīts ar 0,22 μm PVDF membrānu, izmantojot TFF metodi. Uz TFF balstītais dzidrināšanas process tika veikts ar šķērsplūsmas ātrumu 2000 l/h pie 23 grādiem, un dzidrinātais filtrāts tika koncentrēts ar šķērsplūsmas ātrumu 1000 l/h 25 grādu temperatūrā, izmantojot parasto TFF sendvičtipa 30 kD PES membrānu. Dzidrinātais gaļas šķidrums (apmēram 6L) šajā ultrafiltrācijas procesā tiek koncentrēts 10 reizes. Stingumkrampju toksoīdu testi tika veikti koncentrētiem fiksatora paraugiem, lai novērtētu produkta atgūšanu.

Dziļās filtrēšanas rezultātā produkta reģenerācijas līmenis bija aptuveni 89%, bet TFF vienību rezultātā produkta atgūšanas līmenis pārsniedza 97%. Mikrofiltrācijas un ultrafiltrācijas procesi konsekventi nodrošina lielāku produktu atgūstamību nekā NFF process. Šie rezultāti ir balstīti uz flokulācijas testiem (Lf).

 

04Polisaharīdu vakcīnu precizēšana

4.1. Polisaharīdu vakcīnas precizēšanas apsvēršana

Gan nesaistīto/brīvo polisaharīdu vakcīnu, gan saistīto polisaharīdu vakcīnu ražošanas process sākas ar saimniekbaktēriju kultivēšanu fermentētājā. Fermentācijas beigās baktērijas var apstrādāt ar tīrīšanas līdzekļiem, piemēram, DOC (nātrija deoksiholātu), Triton®X-100 vai citiem piemērotiem reaģentiem, lai iznīcinātu baktērijas un veicinātu polisaharīdu izdalīšanos. Lielās akumulatora ietilpības dēļ savākšana tieši caur NFF nav ekonomiski iespējama, jo caurlaidspēja var būt ļoti zema. Tāpēc ideāla izvēle ir izmantot centrifūgu, lai atdalītu šūnu kopas. Var izmantot arī TFF mikrofiltrācijas diapazonu. Bezšūnu centrs/penetrants, kas satur interesējošo polisaharīdu, tiek tālāk dzidrināts ar NFF dziļās filtrēšanas sistēmu, kam seko biofiltrācija, un pēc tam tiek veikta pakārtota apstrāde tālākai attīrīšanai.

 

4.2. Polisaharīdu vakcīnas precizēšanas stratēģija

4.2.1. Pirmā precizēšanas procedūra

Centrifugēšana ir viens no visizplatītākajiem paņēmieniem šūnu atdalīšanai no fermentācijas šķidrumiem. Atkarībā no mēroga var izvēlēties nepārtrauktu centrifugēšanu vai sērijveida centrifugēšanu. Ir svarīgi atzīmēt, ka centrifugēšanas apstākļu un to darbības pareiza optimizācija ir būtiska veiksmīgai pakārtotajai attīrīšanai. Izvēloties konkrētu TFF membrānu un poru izmēru, ir svarīgi paturēt prātā polisaharīdu molekulmasu, kas bieži ir lieli un strukturāli sarežģīti, un to molekulmasa svārstās no aptuveni 500kDa. vairāk nekā 1000kDa. Sakarā ar lielo atvērto poru izmēru, 0,22μm, 0,45μm, 0,65μm MF membrānu izmantošana var nodrošināt veiksmīgu PS molekulu atgūšanu osmotiskajā šķīdumā.

 

4.2.2. Sekundārā precizēšanas procedūra

Bezšūnu fermentācijas šķīduma dzidrums/duļķainums, kas sasniedz sekundāro dzidrināšanas posmu, ir atkarīgs no konkrētajām baktērijām, šķelšanās veida, individuālā seruma tipa un primārajā dzidrināšanas posmā izmantotās metodes. Centra duļķainība var svārstīties no aptuveni 50 līdz 150 NTU. Pozitīvi lādētu frakciju blīvuma dziļo filtru, kas izgatavots no impregnēta diatomīta ar pildītām celulozes šķiedrām, var izmantot, lai notīrītu un samazinātu tā duļķainību līdz < 5NTU.

Šī dziļā filtra tilpuma caurlaidība var svārstīties no aptuveni 150 L/m3 līdz 250 L/m3. Parasti dzidrinātā produkta šķīdumu filtrē caur sekojošu 0,45 μm bioatbalstītu reducēšanas pakāpi vai 0,22 μm sterilizētu membrānu, lai noņemtu visas atlikušās šūnu daļiņas, koloīdus un potenciālos mikroorganismus.

 

4.3. Gadījuma izpēte: Streptococcus pneumoniae fermentācijas buljona centra noskaidrošana pēc centrifugēšanas

Šūnas tika atdalītas, nepārtraukti centrifugējot, pievienojot {{0}},1% (v/v) 8. tipa Streptococcus pneumoniae fermentācijas buljonu (20 l). Kolekcijas centrs tiek filtrēts caur diviem atsevišķiem pozitīvi lādētiem un diatomīta zemes dziļajiem filtriem, kas satur celulozes šķiedras. Pēc tam atsevišķais dziļā filtra filtrāts tika filtrēts caur bioloģiski noslogotu reducēšanas pakāpes PVDF 0, 45 μm membrānu. Visi filtrēšanas testi tika veikti pastāvīgas plūsmas režīmā ar peristaltiskajiem sūkņiem. Filtrēšanas testos, izmantojot uzlādētu dziļo filtru un Streptococcus pneumoniae 8. serotipa fermentācijas buljonu, duļķainība samazinājās no aptuveni 120 NTU līdz 3 NTU. Pārbaudes tika veiktas ar plūsmas ātrumu 140 150 l/m2/h un galapunkta spiediena starpību 20-25 psi, ar tilpuma caurlaidspēju aptuveni 180-200 l/m2.

Līdzīgi filtrēšanas testi tika veikti ar Streptococcus pneumoniae 19A serotipa fermentācijas buljonu. Centrifugētais 19A šķidrums tiek dzidrināts caur uzlādētu dziļo filtru, kas samazina duļķainību no aptuveni 40 NTU līdz 3 NTU. Pārbaudes tika veiktas ar nemainīgu plūsmas ātrumu aptuveni 140-160 L/m2/h, un tilpuma caurlaidspēja 200-230L/m2 tika sasniegta pie galapunkta spiediena aptuveni 15 psid. Filtrēšanas novērtēšanas testu laikā savākto produktu paraugu HLPC analīze neliecināja par būtisku izplūdes zudumu dziļās filtrācijas gadījumā vai 0,45 μm (vai 0,22 μm) membrānām.

 

05 Secinājums

Dzidrināšanas procesu attīstībai ir jāintegrē vairāki vienības procesi, piemēram, centrifugēšana, TFF-MF, dziļā filtrēšana un aseptiskā filtrēšana. Skaidrības procesa optimizācijai ir nepieciešama izpratne par to, kā dažādas vienības darbības ietekmē viena otru. Izaicinājums ir izvēlēties tehnoloģijas un instrumentus (iekārtas un armatūru), lai apmierinātu arvien sarežģītākas prasības attiecībā uz procesa šķidrumiem, ko ražo mūsdienu efektīvākos bioreaktoros. Augšupējās produktivitātes (vīrusu titra, šūnu blīvuma uc), šūnu atlieku un šūnu līzes produktu pieaugums palielina dzidrināšanas procesa grūtības un mulsina atdalīšanas un filtrēšanas aprīkojuma izvēli.

Izvēloties procesa mērogu, jāņem vērā iekārtu dizains, lietošanas vienkāršība un tīrība. Tas nodrošinās efektīvu pārveidošanu un operatora drošību, strādājot ar izmestiem filtriem. Lai attīstītu dzidrināšanas procesu, ir svarīgi stingri integrēt dzidrināšanas posmus, lai nodrošinātu, ka iepriekšējās ražas apstrāde ir rentabla. Lai atvieglotu laboratorijas testēšanu, izmēģinājuma ražošanu un pilna izmēra apstrādi, ir viegli pieejams virkne filtrēšanas iekārtu. Ieviešot labi izstrādātu mērogošanas darba plānu, kurā novērtētas vairākas dzidrināšanas iespējas, var droši atlasīt un izmērīt dzidrināšanas filtrus, lai aizsargātu pakārtotās vienības darbības, vienlaikus samazinot ekspluatācijas izmaksas.

Vakcīnas precizēšana rada vairākas problēmas. Parasti filtrēšanas process ir jāpielāgo ražošanas sistēmai, inaktivācijas vai līzes aģentam un antigēna noformējumam, ne vienmēr vakcīnām. Tradicionālajos vakcīnas procesos parasti izmanto centrifugēšanu, lai sākotnēji notīrītu vakcīnu. Mūsdienu vakcīnas ar vairākām tehnoloģiju platformām un mazākiem apstrādes apjomiem padara vakcīnas piemērotākas dzidrināšanai, izmantojot membrānas tehnoloģijas. Jaunizstrādātās vakcīnas, kurās tiek izmantotas modernas šūnu līnijas un ekspresijas sistēmas un precīzāki šūnu kultivēšanas apstākļi, padara daudzus vakcīnu procesus labvēlīgākus filtrēšanai.

 

Tomēr vakcīnas produktu antigēnā komponenta jeb "mērķa antigēna" neviendabīgums palielina filtrēšanas dzidrināšanas sarežģītību. Antigēni atšķiras pēc izmēra, virsmas ķīmijas un lādiņa. Šīs īpašības ietekmē antigēnu ražu un atjaunošanos. Vakcīnas rada unikālas problēmas precizēšanai, galvenokārt to makromolekulu lieluma dēļ. Tas kopā ar spēju problēmām saistībā ar precizēšanu palielina vajadzību pēc norādēm par procesu attīstības stratēģijām.

Vakcīnas ražošanas komerciālā mēroga darbības apjoms un apjoms būtiski ietekmē dzidrināšanas tehnoloģijas izvēli. Atrodoties procesa sākumā, pareiza dzidrināšanas optimizācija ir ļoti svarīga, lai pakārtotās vienības darbības būtu veiksmīgas, palielinot procesa ražīgumu, reģenerāciju un noturību. Lai gan centrifugēšana joprojām ir dzīvotspējīga tehniska iespēja primārajai dzidrināšanai, vakcīnu rūpniecībā tiek pieņemti atvērto kanālu mikrofiltrācijas bloki (TFF) primārajai dzidrināšanai un smalkie dziļie filtri vai membrānfiltri sekundārajai dzidrināšanai. Šīs izmaiņas izraisa nepieciešamība pēc ātrākas apstrādes, straujas procesu izstrādes, pārnēsājamiem procesiem un vienreizējas lietošanas ieviešanas. NFF piedāvā ekonomisku procesu, kas piemērots maza vai liela mēroga vienreizējās lietošanas iespējām. Sakarā ar mainīgajām normatīvajām vajadzībām, gamma apstarošanas preaseptisko ierīču vai moduļu pieejamība, kas paredzēti autoklāvēšanai, veicina NFF vai TFF balstītu tehnoloģiju ātrāku pielāgošanu.

Daudzi klasiskie vakcīnas procesi ir saistīti ar precizēšanas vienību darbību attīstību, galvenokārt regulējošo ierobežojumu un ar tiem saistītajām augstajām atkārtotas apstiprināšanas un atkārtotas iesniegšanas vai klīnisko pētījumu izmaksām. Platformas process, kurā izmanto uz filtrēšanu balstītu dzidrināšanas shēmu, ir plaši izmantots vairākos bioloģiskajos aģentos ar augstu panākumu pakāpi. Šajā dokumentā izklāstītie piemēri un gadījumi liecina, ka vakcīnu ražotājiem ir potenciāls sasniegt šo stabilitātes, ekonomiskās dzīvotspējas un vienreizējās lietošanas lietderības līmeni, izmantojot veidnes pieeju.

Citas filtrēšanas priekšrocības salīdzinājumā ar centrifugēšanu ir pret bīdi jutīgi vīrusi vai vīrusi, kuriem ir tendence uzkrāties gaisa saskarnē. Tā kā ierīču ražotāji tirgū ievieš jaunus produktus, vakcīnu ražotāji joprojām būs labāk sagatavoti noskaidrošanas procesam.

 

Kā pirmais uzņēmums lokalizācijas ķēdē Guidling Technology ir uzkrājis pietiekamu atbilstošu pieredzi vakcīnu noskaidrošanā. Guidling Technology ir izstrādes un ražošanas uzņēmums, kas koncentrējas uz biofarmaceitisko un šūnu kultūru, attīrīšanu un atdalīšanu. Produkti tiek plaši izmantoti biomedicīnā, diagnostikā, rūpnieciskā šķidruma filtrēšanas, noteikšanas, dzidrināšanas, attīrīšanas un koncentrēšanas procesā; Guidling ir veiksmīgi izstrādājis ultrafiltrācijas centrifūgas cauruli, ultrafiltrācijas/mikrofiltrācijas membrānas kaseti, vīrusu noņemšanas filtru, tangenciālās plūsmas filtra ierīci, dziļo membrānu skursteni utt., kas pilnībā atbilst biofarmaceitiskās un šūnu kultūras pielietojuma scenārijiem.

Mūsu membrānas un membrānfiltrus plaši izmanto priekšfiltrācijas, mikrofiltrācijas, ultrafiltrācijas un nanofiltrācijas koncentrēšanai, ekstrakcijai un atdalīšanai. Mūsu plašais produktu līniju klāsts, sākot no mazas vienreizējas lietošanas laboratorijas filtrēšanas līdz ražošanas tipa filtrēšanas sistēmām, sterilitātes pārbaudei, fermentācijai, šūnu kultūrai un citiem, var apmierināt testēšanas un ražošanas vajadzības.