Pētījums par tradicionālās kolonnu hromatogrāfijas aizstāšanu ar membrānas hromatogrāfiju monoklonālo antivielu attīrīšanai

Tradicionālā slāņa -slāņa hromatogrāfija ir nobriedusi un uzticama, taču to ierobežo tādi ierobežojumi kā zema difūzijas efektivitāte, augsts pretspiediens un lēns apstrādes ātrums, tāpēc kļūst arvien grūtāk sekot līdzi nepārtraukti augošajam augšupejošo procesu produktivitātei. Nesen tika publicēts pētījumsBiotehnoloģijas progressir radījis potenciālu izrāvienu nozarē: ar izcili augstu produktivitāti un robusto izturību membrānas hromatogrāfija var kļūt par efektīvu alternatīvu -slāņa hromatogrāfijai un būtiski pārveidot pakārtotās mAb attīrīšanas ainavu.

Pētījuma priekšvēsture

 

Pētījumā tika sistemātiski novērtētas dažāda veida membrānas hromatogrāfijas ierīces, tostarp jonu -apmaiņas un proteīna A afinitātes membrānas, un veikts visaptverošs salīdzinājums ar tradicionālo iepakoto-slāņa hromatogrāfiju vairākās dimensijās, tostarp saistīšanas spēju, piemaisījumu attīrīšanu, kalpošanas laiku un kopējo attīrīšanas veiktspēju. Pētījumam tika atlasīti trīs rekombinantie proteīni -viena monoklonālā antiviela (mAb) un divi Fc-fūzijas proteīni-, kas aptver visu pakārtoto attīrīšanas procesu no uztveršanas līdz pulēšanai. Galvenie testa rezultāti ir šādi:

 

1. Uztveršanas solis: proteīna A membrānas hromatogrāfija - augsta saistīšanās jauda īsā uzturēšanās laikā

Proteīna A hromatogrāfija ir kritisks solis mAb uztveršanā. Pētījumā tika novērtēta četru proteīna A membrānu (trīs komerciāli produkti un viena membrānas prototipa) veiktspēja, salīdzinot ar diviem standarta sveķiem.

• Izcila dinamiskās saistīšanas jauda (DBC):Divas membrānas sasniedza DBC vērtības, kas pārsniedza 50 g/l. Dažas membrānas saglabāja saistīšanās kapacitāti 35–65 g/l pat pie ārkārtīgi īsa uzturēšanās laika 0,2 minūtes, kas ir salīdzināma ar tradicionālajiem iepakoto -slāņa sveķiem (37–55 g/l).
• Dramatisks produktivitātes pieaugums:Membrānas hromatogrāfijas uzturēšanās laiks bija tikai 1/6–1/30 no tradicionālās kolonnas hromatogrāfijas (0,13–0,33 min pret . 2–6 min), kā rezultātāPartiju apstrādes produktivitātes pieaugums 12–35 reizes.
• Stabila atveseļošanās:Olbaltumvielu atgūšana pārsniedza 85% visām membrānas ierīcēm. GORE membrāna sasniedza visaugstāko atgūšanu — 96%, kas būtībā ir salīdzināms ar tradicionālajiem iepakoto -slāņa sveķiem (94–98%).
• Ierobežojumi, kas jāņem vērā:Membrānas hromatogrāfija radīja eluēšanas tilpumu1,4-5 reizes lielāksnekā tradicionālie pildītie{0}}gultas sveķi, savukārt HCP klīrenss bija nedaudz zemāks. Dažām membrānām HCP līmenis eluātā sasniedza 7000 ppm, salīdzinot ar 4700 ppm tradicionālajiem pildītas -slāņa sveķiem. Tāpēcvar būt nepieciešami papildu pulēšanas posmi, lai kompensētu šo ierobežojumu.

 

2. Pulēšanas solis: jonu-apmaiņa/multimodālās membrānas - efektīva piemaisījumu noņemšana ar ātru apstrādi

Pulēšanas posma galvenais mērķis ir noņemt atlikušos piemaisījumus, piemēram, augstas -molekulāras- (HMW) agregātus un saimniekšūnu proteīnus (HCP). Pētījumā tika novērtēti trīs membrānu hromatogrāfijas veidi: anjonu apmaiņas (AEX), katjonu apmaiņas (CEX) un multimodālās (MM) membrānas.

• Rekords{0}}produktivitāte:Uzturēšanās laiks membrānas hromatogrāfijai bija tikai0,17 min, salīdzinot ar2–4 mintradicionālajai kolonnu hromatogrāfijai, kas attēlo a12–24 reizes samazinās uzturēšanās laiksun dramatisks apstrādes efektivitātes pieaugums.
• Piemaisījumu attīrīšana ir salīdzināma ar tradicionālo kolonnu hromatogrāfiju:Panākta membrānas hromatogrāfijaHMW klīrensa koeficienti 4,2–5,5, tuvojas Capto Adhere sveķu veiktspējai (6). TheHCP klīrensa koeficients sasniedza pat 60, ar dažām membrānām pārspējot tradicionālo -pakotās gultas hromatogrāfiju.
• Konkurētspējīga olbaltumvielu atgūšana:Lielākā daļa membrānu sasniegtsolbaltumvielu atgūšana virs 90%, un dažiem Fc-fūzijas proteīniem atgūšana bija pat lielāka, nekā iegūta ar tradicionālo kolonnu hromatogrāfiju.

 

3. Pilna-procesa validācija: membrānas hromatogrāfija nodrošina augstas-tīrības pakāpes attīrīšanu

Pētījums noteica anintegrēts uz membrānu{0}} balstīts attīrīšanas process, kas apvieno A proteīna uztveršanu ar pulēšanu, un tieši salīdzināja to ar parasto -slāņa hromatogrāfijas procesu:

• Augsta{0}}tīrības pakāpe:Pēc pilna membrānas{0}}attīrīšanas procesa HCP līmenis Fc-fūzijas proteīnos tika samazināts līdzzem 50 ppm, ar agregātiem (HMW sugas) plkstMazāks vai vienāds ar 0,5%. Monoklonālajai antivielai HCP tika samazināts līdz226 ppm, ar agregātiem plkst1.0%, tuvojas parastā pildītās{0}}slāņa hromatogrāfijas procesa veiktspējai (11 ppm HCP un 0,7% agregātu).
• Augstāka vispārējā atveseļošanās:Sasniegta kopējā Fc-fūzijas proteīna atgūšana89%, kas bijapar 19% augstāksnekā parastajā -slāņa hromatogrāfijas procesā. Monoklonālajai antivielai atveseļošanās bija73%, kas ir salīdzināms ar parasto iepakotas{0}}gultas procesu.
• Spēcīga piesārņojuma pretestība:Membrānas hromatogrāfija parādīja labāku toleranci pret izejvielām ar lielu piemaisījumu slodzi un saglabājās efektīva pat tad, kadsākotnējā HCP koncentrācija sasniedza 150 000 ppm.

 

4. Kalpošanas laiks: stabila darbība 100+ cikliem atbilst ražošanas prasībām

Membrānas izturība ir būtisks faktors rūpnieciskai lietošanai. Pētījumā tika novērtēta membrānas stabilitāte caur201 secīgs darbības cikls:

• Pagarināts cikla mūžs:Pabeigtas septiņas no astoņām membrānāmvairāk nekā 100 cikli, kamēr sasniedza multimodālās (MM) membrānas prototipu201 ciklsbez būtiskas veiktspējas pasliktināšanās.
• Stabila veiktspēja:Visā riteņbraukšanas pētījuma laikāolbaltumvielu atgūšana saglabājās aptuveni 90%, bez būtiska HMW vai HCP noņemšanas veiktspējas samazināšanās. Arī spiediena profili saglabājās stabili.
• Piemērots ražošanas vajadzībām:Lielākā daļa membrānu bija spējīgas atbalstītvismaz vienu pilnu ražošanas ciklu, savukārt daži varētu atbalstīt vairākas partijas. Uzkrāto spiediena pieaugumu var mazināt, optimizējottīras-vietā-(CIP) stratēģija.

 

Tehniskie aspekti: kāpēc membrānas hromatogrāfija var aizstāt tradicionālo kolonnu hromatogrāfiju?

Membrānas hromatogrāfijas galvenās priekšrocības izriet no tās unikālas plakanas{0}}lokšņu membrānas struktūras. Salīdzinot ar parastajiem porainajiem hromatogrāfijas sveķiem, membrānas hromatogrāfija piedāvā trīs galvenās atšķirības:

1. Novatorisks masas pārneses mehānisms:Membrānas galvenokārt balstās uz konvektīvu masas pārnesi, novēršot nepieciešamību pēc proteīniem difundēt porainā vidē. Tas ievērojami samazina uzturēšanās laiku un nodrošina daudz ātrāku apstrādi.
2. Ievērojami zemāks pretspiediens:Plakanā -loksnes struktūra nodrošina zemu plūsmas pretestību un var uzņemt lielāku plūsmas ātrumu, pārvarot pretspiediena ierobežojumus, kas parasti saistīti ar tradicionālo kolonnu hromatogrāfiju.
3. Spēcīga procesa pielāgošanās spēja:Membrānas hromatogrāfija ir saderīga ar nepārtrauktu ražošanu un var labāk atbilst augšējo procesu augstajai produktivitātei. Turklāt tā mazākais aprīkojuma nospiedums un zemākas prasības membrānas materiālam var palīdzēt samazināt kopējās ražošanas izmaksas.

Protams, membrānas hromatogrāfijai ir arī noteikti ierobežojumi. Tie ietverlielāki eluēšanas tilpumi, kas prasa papildu bufera patēriņu; nepieciešamība turpināt uzlabot piemaisījumu klīrensu grūtiem paraugiem, piemēram,bispecifiskās antivielas (bsAbs); un ierobežota dažu membrānas produktu pieejamība lielos ražošanas apjomos. Tomēr šīs problēmas var pakāpeniski risināt, optimizējot aprīkojuma dizainu, iekļaujot papildu dziļuma{1}filtrēšanas darbības un citus procesa uzlabojumus.

Ietekme uz nozari: monoklonālo antivielu ražošana ieiet augstas efektivitātes{0}}attīrīšanas laikmetā

Šī pētījuma rezultāti sniedz biofarmācijas nozarei skaidru virzienu tehnoloģiju attīstībai. Parastajiem mAb un Fc-fūzijas proteīnu attīrīšanas procesiem, kuriem prioritāte ir augsta produktivitāte,membrānas hromatogrāfijā ir potenciāls pilnībā aizstāt tradicionālo pildītās{0}}kolonnas hromatogrāfiju. Pat sarežģītākām izejvielām kombinācijas stratēģija, izmantojot membrānas hromatogrāfiju kopā ar parastajiem hromatogrāfijas sveķiem, var palīdzēt sasniegt optimālu līdzsvaru starp apstrādes efektivitāti un produkta tīrību.

Tā kā membrānas materiālu tehnoloģijas turpina attīstīties, paredzams, ka turpmākā attīstība turpinās samazināt bufera patēriņu un uzlabot mērogojamību, paātrinot biofarmācijas nozarinepārtraukta, augsta{0}}efektivitāte un izmaksu{1}}efektīva ražošana.

Biofarmaceitisko preparātu ražotājiem,agrīna membrānas hromatogrāfijas ieviešana un stratēģiska ieviešana varētu kļūt par nozīmīgu konkurences priekšrocību mainīgajā tirgū.