Kopsavilkums:

Šajā rakstā ir apskatīti divi galvenie faktori, kas jāņem vērā olbaltumvielu attīrīšanas stratēģijās: pakārtotās lietošanas prasības un pašu olbaltumvielu bioloģiskās īpašības. Rakstā uzsvērts, ka augstas kvalitātes olbaltumvielu attīrīšana ir eksperimentālo datu uzticamības un atkārtojamības pamats, īpaši rekombinanto olbaltumvielu ražošanai. Dažādiem lietojumprogrammu scenārijiem ir īpašas prasības olbaltumvielu tīrībai, aktivitātei vai endotoksīna saturam, un olbaltumvielu raksturlielumi var ievērojami ietekmēt attīrīšanas stratēģijas. Saskaņā ar īpašiem gadījumiem raksts parāda, ka unikālajiem proteīniem būtu jāpieņem pielāgotas attīrīšanas shēmas. Visbeidzot, tika ierosināts sistemātisks olbaltumvielu ražošanas process (1. attēls), uzsverot pilna procesa kvalitātes kontroli no ekspresijas sistēmu atlases, būvniecības dizaina līdz attīrīšanas optimizācijai un iesakot novērtēt olbaltumvielu viendabīgumu un funkcionalitāti, izmantojot biofizikālās metodes (piemēram, Sec-Mals, DSF utt.). Šī raksta mērķis ir nodrošināt praktiskus norādījumus pētniekiem, palīdzot viņiem formulēt efektīvas un atkārtojamas attīrīšanas stratēģijas, pamatojoties uz mērķa olbaltumvielu īpašībām un pielietojuma prasībām, tādējādi uzlabojot zinātnisko pētījumu kvalitāti un efektivitāti.

 

1. attēls. Olbaltumvielu ražošanas procesa shematiska diagramma

 

Augsta pieprasījuma olbaltumvielu ražošana - problēmu identificēšanas, mazināšanas stratēģijas izstrādes un atbilstošās izvades piemēri

 

1.Nukleīnskābes saistīšanās ar olbaltumvielām:

Attīrot nukleīnskābju saistīšanas olbaltumvielas, nukleīnskābju piesārņojuma noņemšanai ir nepieciešami vairāki soļi. Līzes laikā jāpievieno nukleāzes (piemēram, SM nukleāze (Benzonase®) vai DNase vai RNase), bet saistītās nukleīnskābes nevar pilnībā noņemt. Nomainiet nukleīnskābju noņemšanas posmus, piemēram, PEI vai streptomicīna sulfāta nokrišņus, heparīna attīrīšanu vai jonu apmaiņas hromatogrāfiju. Nukleīnskābju klātbūtni uzraudzīja ar A26 0 nm/A28 0 nm attiecību visā attīrīšanas procesā. Ja attiecība bija zemāka par 0,6, tā norādīja, ka olbaltumvielu tīrība bija salīdzinoši augsta un nukleīnskābes piesārņojums bija minimāls. Olbaltumvielām ar cieši saistītām nukleīnskābēm tos var īslaicīgi denaturēt (piemēram, ārstēt ar urīnvielu) un pēc tam atkāpties. Galvenie punkti: izmantojiet augstas kvalitātes reaģentus, svaigus buferus un tīras kolonnas (pirms lietošanas notīriet ar 0,5 m NaOH).

 

2. Peles feritīna smagā ķēde:

Attīrīta peles feritīna smagās ķēdes (MFTH1) olbaltumvielu ražošanas mērķis ir augstas izšķirtspējas vienas daļas krioelektronu mikroskopija (krio-EM). Escherichia coli ekspresijas vektors, kas kodēts bez etiķetes MFTH1, tika ultrasoniski traucēts, nepievienojot nekādu nukleāzi. Pēc sildīšanas pie 7 0 pakāpes tam tika veikti amonija sulfāta nokrišņu, dialīzes un lieluma izslēgšanas hromatogrāfijas posmi. Iegūtais paraugs parādīja lielu daudzumu piesārņotāju klātbūtni krio-elektronu mikroskopijas attēlos (2.A attēls), kas bija pilnīgi nepiemērots tā pielietošanai. Optimizējiet darbības. Pievienojiet SM nukleāzi šūnu līzes procesā un dialīzes procesu pēc amonija sulfāta nokrišņu un pēc tam pievienojiet anjonu apmaiņas hromatogrāfijas soli, lai samazinātu A26 0 nm/A280nm attiecību no 1,4 līdz 0,8. Pēc lieluma izslēgšanas hromatogrāfijas galīgā MFTH1 parauga A260NM/A280NM attiecība bija 0,56. SDS-PAGE un krio-elektronu mikroskopijas attēli (2.B attēls) parādīja, ka olbaltumviela ir ļoti tīra, norādot, ka piesārņotāji ir efektīvi noņemti.

2. attēls peles feritīna smagā ķēde

 

 

 

3. Chimeric olbaltumvielu cilvēka DSRBEC (DSRBD-EGF-Chimera):

DSRBEC veidojas, saplūstot ar divpavedienu RNS saistošo domēnu (DSRBD) no cilvēka olbaltumvielu kināzes R un cilvēka epidermas augšanas faktora (HEGF). Kad DSRBD tiek izteikts Escherichia coli, tas parāda ārkārtīgi augstu dsRNS saistīšanas spēju. Pēc šūnu līzes piesārņojuma RNS kavēs rekombinanto olbaltumvielu saistīšanos ar fiksētā metāla jonu afinitātes hromatogrāfijas (IMAC) kolonnu. Parastās metodes, piemēram, PEI vai streptomicīna sulfāta nokrišņi, RNāzes apstrāde vai augsta sāls bufera šķīdumi, nevar noņemt RNS. Šūnu līze tika veikta, izmantojot buferi, kas satur 4M urīnvielu. Supernatants tika ielādēts iMac kolonnā, un 4M līdz 0 m urīnviela lēnām tika izmantota nakti (kolonnas renaturācija). Renaturācijas buferis tika pievienots ar imidazolu un eluēts no IMAC kolonnas. Galīgais uzlabojums tika veikts, izmantojot Superdex 75 gēla filtrēšanu, lai iegūtu funkcionāli aktīvu DSRBEC.

 

4. Olbaltumvielas, kas saistītas ar divvērtīgiem katjoniem vai citiem kofaktoriem:

Proteīniem, kas mijiedarbojas ar divvērtīgiem katjoniem, piemēram, Zn 2+, Fe 2+, Cu 2+ vai citi kofaktori, ekspresijas laikā ir svarīgi pievienot specifiskus divvērtīgus katjonus (vai citus kofaktorus). Attīrīšanas procesā ir nepieciešams arī neliels daudzums to pašu divvērtīgo katjonu (vai citu kofaktoru). Tomēr jāizvairās no jebkura helātu līdzekļu (piemēram, EDTA, EGTA) un helātu reducējošo līdzekļu (piemēram, DTT vai DTE) izmantošanas. Darbojoties ar olbaltumvielām, kas saistītas ar divvērtīgiem katjoniem, ar spektroskopisko metožu (piemēram, atomu absorbcijas spektrofotometriju) ir jāizmanto proteāzes inhibitoru sajaukums bez helātu līdzekļiem, lai apstiprinātu divvērtīgu katjonu (vai citu kofaktoru) klātbūtni (vai citu kofaktoru).

 

5. Rekombinantā ferridoksīns (RFD), kas satur vienu [2fe ± 2s] kopu no termofīlās zilaļģes mastigokladus laminosus

Ferridoksīns ir šķīstošs dzelzs-sēra proteīns, kas piedalās elektronu pārneses reakcijās. Augu tipa ferroredoksīnam ir viens [2fe ± 2s] klasteris kā fotosistēmas. IMAC uztveršanas kolonnas eluēšana tika veikta, izmantojot buferi, kas satur 10 mm histidīnu, lai izvairītos no imidazola un novērstu [2fe ± 2s] klastera iznīcināšanu. ANON apmaiņa un lieluma izslēgšanas hromatogrāfija tika izmantota turpmākai attīrīšanai un koncentrācijai līdz 12 mg/ml kristalizācijas skrīningam. Salīdzinot ar feroredoksīna rekombinanto ražošanu, dabiskais ferroredoksīns, kas attīrīts no zili zaļajām aļģu mastigokladus laminosus, kristalizācijas laikā sasniedza augstāku izšķirtspēju.

 

6. olbaltumvielas, kuras izmanto kā antigēnus

Olbaltumvielas bieži tiek izmantotas kā antigēni, lai atgūtu mērķim specifiskus ligandus. Pirmais, kas jāņem vērā, ir tas, vai olbaltumviela tiek izmantota in vivo imunitātei, lai iegūtu parasto monoklonālo vai poliklonālo IgG, vai programmām, kas saistītas ar kamieļu IgG vai in vitro atlases procesiem.

 

6.1 Antigēni, ko izmanto ikdienas antivielu ražošanai

Ja antigēniem izmanto, lai iegūtu monoklonālas IgG antivielas, pareiza antigēna locīšana parasti nav nepieciešama, jo vairums monoklonālo antivielu atpazīst lineāros epitopus, kurus antigēna struktūra nav ievērojami ietekmējusi, un pat denaturēti antigēni (piemēram, iekļaušanas ķermeņa proteīni) joprojām ir efektīvi. Tomēr tīrība ir stingri jākontrolē, lai izvairītos no spēcīgiem imunogēniem piesārņotājiem, kas traucē imūno reakciju un izraisītu nemainīgu antivielu dominēšanu.

 

6.2 Konjugētās bibliotēkas skrīnings

Īpaša uzmanība jāpievērš antigēna dabiskās konformācijas saglabāšanai nanobodiju bibliotēkas apstrādes laikā, kas iegūta ar kamieļu imunizāciju. Atšķirībā no parastajām antivielām, kamieļu antivielām (īpaši nanobodijām) ir tendence atpazīt strukturālos epitopus, kas ir saistīti ar to unikālo izliektu papildinošo vietu struktūru. Līdzīgi, skrīnējot lielas sintētiskas vai dabiskas antivielu bibliotēkas in vitro, antigēnam jāuztur struktūra, kas pilnībā atbilst mērķa pielietojumam. Tā kā pats skrīninga process nav aizspriedumains, ja antigēnam ir nepareiza salocīšana, agregācija vai konformācijas neviendabīgums, var izsvītrot lielu skaitu konjugātu, kas mērķēti uz dabiskiem epitopiem.

 

 

 

7. Olbaltumvielas, kas satur starpmolekulāras vai intramolekulāras disulfīda saites vai brīvu cisteīnu

Disulfīdu saitēm ir izšķiroša nozīme olbaltumvielu dabiskās struktūras stabilizēšanai. Attīrīšanas procesa laikā, attīrot olbaltumvielas, kas satur starpmolekulāras vai intramolekulāras disulfīda saites, ir jāizvairās no reducējošo līdzekļu pievienošanas, lai novērstu olbaltumvielu konformācijas izmaiņas, tādējādi mainot to funkcijas. Olbaltumvielām, kas satur brīvu cisteīnu, reducējošie līdzekļi ir nepieciešami visos attīrīšanas procesa posmos, īpaši uzglabāšanas laikā, lai novērstu mākslīgo disulfīdu saites. Visbiežāk izmantotie reducējošie līdzekļi ir ditiotreitols (DTT), -Mercaptoetanol (-me) un Tris (2- karboksietil) fosfīna hidrohlorīds (TCEP). IMAC sveķiem, kas nav savienojami ar DTT vai TCEP, turpmākajās darbībās ieteicams tos izmantot -me un aizstāt tos ar citiem reducējošajiem līdzekļiem.

 

8. Rekombinantas antivielu fragments

Lai arī rekombinanto antivielu fragmentu (piemēram, nanobodiju) struktūra ir vienkāršāka nekā IgG, to funkcija ir atkarīga no pareizas disulfīdu saites veidošanās. Baktēriju ekspresijas sistēmās, pat izmantojot optimizācijas stratēģiju, joprojām var rasties nepareizi salocīti vai daļēji salocīti produkti, kas pastāv gan šķīstošajā daļā, gan iekļaušanas ķermenī. Vairāk slēpts ir tas, ka pat pareizi salocīti antivielu fragmenti var veidot šķīstošus agregātus (koloīdu agregāciju) caur hidrofobām plāksnēm uz virsmas. Šādus agregātus ir grūti identificēt ikdienas funkcionālos testos (piemēram, ELISA), jo daudzvērtīga saistīšanās var maskēt monomēru afinitātes samazināšanos, taču to klātbūtne var nopietni ietekmēt lietojumprogrammas, kas balstās uz mazu molekulu lielumu (piemēram, superizšķirtspējas mikroskopija). Tāpēc, lai novērtētu parauga kvalitāti, nepietiek tikai uz SDS-PAGE, lai novērtētu parauga kvalitāti. Lai atšķirtu monomērus (galvenās virsotnes) no agregātiem (izslēgšanas tilpuma virsotnes), jāizmanto biofizikālās metodes, piemēram, gēla filtrēšana (3. attēls). Galvenie vadības punkti ietver: redox vides optimizēšanu ekspresijas laikā, lai veicinātu disulfīda saites veidošanos, un uzglabāšanas apstākļu optimizēšana pēc attīrīšanas, lai novērstu agregāciju. Šie pasākumi ir izšķiroši, lai nodrošinātu antivielu fragmentu monodispersitāti un funkciju.

3. attēls. Nanobodiju šķīstošo agregātu šķīstošo agregātu atdalīšana

 

9. Limfocītu receptora LLT1 šķīstošie fragmenti

Disulfīdu saites atkarīgu olbaltumvielu (piemēram, limfocītu receptoru LLT1) rekombinantā ekspresija bieži saskaras ar locīšanas grūtībām. Savvaļas tipa LLT1 gēla filtrēšana parādīja agregācijas virsotnes un dimēru virsotnes (4.A attēls), bet masas spektrometrija atklāja nepareizu salocīšanu, ko izraisīja nepāra cisteīns dimērā (4.B attēls). Šim nolūkam tika izstrādāti divi mutanti: viens noņems problēmu cisteīnu, kā rezultātā pēkšņi samazinājās raža (4.A attēls); Pēc neocisteīna ieviešanas, lai rekonstruētu atbilstošo disulfīda saiti, mutantam bija ne tikai augsta raža un laba stabilitāte, bet arī varēja izkristalizēt (4.C attēls), un 3D struktūra apstiprināja, ka mutants veido pareizu disulfīda saiti un uzturēja dabisko saliekšanu. Šis gadījums parāda, ka, racionāli izstrādājot konformālās disulfīda saites, apvienojumā ar gēla filtrēšanu un masas spektrometrijas analīzi, rekombinanto olbaltumvielu locīšanas problēmu var efektīvi atrisināt un var iegūt funkcionālos proteīnus ar stabilām struktūrām un augstu ražu.

4. attēls. Disulfīda saites rekonstrukcija uzlabo šķīstošā LLT1 salocīšanu un ražu

 

 

 

10. Viegli agregabējami olbaltumvielas

Rekombinanto olbaltumvielu attīrīšana bieži saskaras ar agregācijas problēmu, un tā veidošanās seko "kodolizācijas izaugsmes" mehānismam-vispirms veidojas neliels daudzums šķīstošu agregātu un pēc tam izraisa liela mēroga nešķīstošu agregāciju. To address this challenge, multi-level strategies need to be adopted: At the expression stage, this can be achieved by optimizing the strain, reducing the culture temperature, using modified culture media or different solubilizing fusion proteins, and replacing expression systems (insect/mammalian cells), etc. During the purification stage, rapid operation (in a 4 degree C environment) is required to avoid excessive protein concentration, and a "rapid purification strategy" (such as direct connection of IMAC uz SEC) ir jāpieņem, lai nekavējoties noņemtu kopējos kodolus. Vispārīgi runājot, jāņem vērā skrīninga bufera šķīdumi, jāņem vērā tādi faktori kā komponentu sastāvs, pH vērtība, atdalīšanas līdzeklis vai šķīdinātājs (5. attēls). Ar smalku ortogonālo noteikšanas optimizāciju (piemēram, SEC, CD, LS, DSF un temperatūras maiņu, pamatojoties uz fluorescences siltumu utt.), Tika noteikta olbaltumvielu kvalitāte un vispiemērotākais buferšķīdums.

5. attēls. Olbaltumvielu agregācijas mazināšanas stratēģijas

 

11. Cilvēka CLK1 kināzes kristalizācija (kā iegūt reproducējamas partijas)

Lai iegūtu viendabīgu nefosforilētu CLK1 kināzi kristalizācijas pētījumiem, tika pieņemta vairāku stratēģiju sadarbības shēma. Pirmkārt, tas tika ekspresēts ar λ -fosfatāzi Escherichia coli, lai novērstu autofosforilēšanas neviendabīgumu. Lai arī raža tika samazināta, tika nodrošināta pilnīga defosforilēšana. Pēc IMAC sagūstīšanas eluents tika papildināts ar stabilizatoriem (50 mm arginīns, 50 mm glutamīnskābe un 10 mm DTT), lai novērstu agregāciju, koncentrētu, un viņa tagu noņem ar TEV sagremošanu. Pēc tam pareizo oligomēru atdalīja ar SEC (satur 5% glicerīna un -me). Galīgais izšķirošais anjonu apmaiņas solis izšķir kristāliskās (nefosforilētās) un ne-kristāliskās (daļēji fosforilētās) CLK1 grupas. Īpaši vērts atzīmēt, ka šūnu līzes veids būtiski ietekmē olbaltumvielu stabilitāti-augstspiediena un augstas temperatūras metode noved pie neatgriezeniskas CLK1 agregācijas, uzsverot vieglas ārstēšanas nozīmi kināzes sagatavošanā.

 

 

 

12. ražo galektīnu -1 ar stabilu ligandu saistīšanas spēju

Lai sagatavotu funkcionālu galektīnu -1 ligandu saistīšanas pētījumiem, tika salīdzināti četru konstrukciju (bez etiķetes un viņa iezīmētā savvaļas tipa galektīna {-1 {} -1) ekspresijas un attīrīšanas stratēģijas. Galvenie atklājumi norāda, ka laktozes afinitātes hromatogrāfijas attīrīšana var efektīvi pārbaudīt pareizi salocītus olbaltumvielas, bet tas ir jāapvieno ar rūpīgu dialīzi (HEPES buferšķīdumu), lai pilnībā noņemtu laktozi no saistīšanas vietas un atjaunotu CRD aktivitāti. Savvaļas tipa galektīns -1 ir pakļauts oksidēšanai un inaktivācijai, un tā stabilitāte joprojām ir ierobežota pat reducējošo līdzekļu klātbūtnē (6. attēls). Tomēr mutants, kas nesatur cisteīnu, ievērojami palielina ilgtermiņa stabilitāti, vienlaikus saglabājot salīdzināmu aglutinācijas aktivitāti un termisko stabilitāti (pārbaudot ar NANODSF, ITC utt.), Izslēdzot disulfīda saites atkarību.

6. attēls. Rekombinantā galektīna -1 hidrodinamiskais raksturojums atklāj tā nestabilitāti

 

13. Endotoksīna noņemšana

Endotoksīna noņemšanas metode ir balstīta uz afinitātes hromatogrāfiju, ieskaitot pozitīvi lādētu hromatogrāfiju (anjonu apmaiņu), polikācijas ligandu (piemēram, poli-l-lizīna (PLL), imobilizēta poliamīna (polimyxin b)) izmantošanu un virsmaktīvās vielas triton x -114 pievienošanu. Attīrīšanas procesa laikā pievērsiet uzmanību buferšķīduma sagatavošanai ar ūdeni, kas nesatur LPS, un izmantojiet jaunas kolonnas vai kolonnas, kuras ir izmantotas tikai citās bez LPS attīrīšanas. Endotoksīna piesārņojumam hromatogrāfijas sūkņa/šķidruma sistēmu var inkubēt nakti 0. 5M NaOH vai 4 stundas 1. 0 m NaOH. Galīgais LP daudzums paraugā tika novērtēts, izmantojot limulus amebocītu lizāta reaģentu (LAL), un tika pārbaudīts, vai tas ir zemāks par ierobežojumu, kas vajadzīgs konkrētai lietojumprogrammai.

 

14. Olbaltumvielu komplekss

Olbaltumvielu kompleksu ekspresija un attīrīšana ir jāoptimizē atbilstoši īpašiem apstākļiem. Izaicinājumi ietver apakšvienību nestabilitāti vai nepareizu salocīšanu. Katru apakšvienību var izteikt patstāvīgi un salikt in vitro vai līdz ekspresēt, veidojot funkcionālos olbaltumvielu kompleksus. Būvniecības dizains ir rūpīgi jāievieš ar attīrīšanas vai noteikšanas etiķetēm, lai izvairītos no traucējumiem montāžā, it īpaši, ja sarežģītā informācija ir ierobežota un nepieciešama vairākas optimizācijas. Attīrīšanas procesa laikā jānovērtē kompleksa integritāte un stabilitāte. Metodes ietver SDS-PAGE (apakšvienību noteikšana), SEC (viendabīgums), SEC-Mals (molārā masas analīze), masas fotometrija vai dabiskās masas spektrometrija (masas pārbaude). Jāatzīmē, ka komplekss var atdalīties zemā koncentrācijā. Šajā laikā ir jāoptimizē hromatogrāfijas metode vai buferis (piemēram, caur termisko dreifu vai DSF skrīninga apstākļiem). Turklāt attīrīšanas posmu samazināšana var novērst vāju mijiedarbības apakšvienību zaudēšanu un līdzsvarot attīrīšanas efektivitāti un kompleksa integritāti.

 

 

 

15. Antigēna-antivielu kompleksu attīrīšana

Antivielu-antigēnu kompleksi ir tipiski olbaltumvielu kompleksu piemēri. Viņu kopsavilkums var atklāt saistīšanas modeļus un virzīt antivielu inženierijas optimizāciju. Tradicionālajām metodēm ir nepieciešama atsevišķa antigēnu un antivielu attīrīšana un pēc tam to sajaukšana. Tomēr jaunākie pētījumi parādīja, ka efektīvākas ir koekspresijas un līdzdalībniecības stratēģijas. Lai iegūtu kompleksu, ir nepieciešama tikai viena attīrīšana, un tajā pašā laikā nestabilus antigēnus var stabilizēt, izmantojot antivielas, un var sasniegt pat bez etiķetes izteiksmi. Šajā īpašajā situācijā SDS-PAGE un gēla filtrēšana (SEC) parasti ir pietiekama, lai novērtētu kompleksa tīrību un kvalitāti.

 

Kopsavilkums

Olbaltumvielu attīrīšana ir pamatintehnika zinātniskos pētījumos. Akadēmiskā mēroga olbaltumvielu ražošana parasti seko standarta stratēģijām un var radīt miligramu līmeņa augstas tīrības pakāpi, šķīstošos proteīnus, kurus plaši izmanto strukturālajā bioloģijā, bioķīmijā un funkcionālajā pētījumā. Tomēr pakārtotās lietojumprogrammu īpašās prasības (piemēram, nepieciešamība pēc endotoksīna eksperimentos dzīvnieku un bez nukleāzes piesārņojuma nukleīnskābju izpētē) vai olbaltumvielu raksturīgajām īpašībām (piemēram, vienkārša agregācija, kas satur disulfīdu saites vai augstu nukleīnskābes afinitāti), bieži ir nepieciešami pielāgoti šķīdumi. Šis pārskats, reaģējot uz šiem īpašajiem apstākļiem, ierosina izsmalcinātas stratēģijas, sākot no ekspresijas sistēmu izvēles, konstrukciju projektēšanas (etiķešu un domēna robežu optimizēšana) līdz attīrīšanas procesam un galvenajos posmos ievieš kvalitātes kontroli (piemēram, SEC, SDS-PAGE, aktivitātes noteikšanu utt.). Dažiem lietojumiem ir nepieciešama arī papildu analīze (piemēram, endotoksīna noteikšana un nukleīnskābju atlikumu noteikšana), līdzīgi kā "kvalitātes nodrošināšanas" (QA) koncepcija biofarmācijas nozarē, tas ir, lai novērstu defektus, izmantojot sistemātiskus procesus. Formulējot kvalitātes kontroles vadlīnijas un noskaidrojot īpašus zinātniskos pētījumos izmantotos olbaltumvielu reaģentus, mērķis ir noteikt stingrākas olbaltumvielu attīrīšanas normas akadēmiskajām laboratorijām, uzlabot eksperimentālo datu ticamību un atkārtojamību un novērst plaisu starp pamatpētījumu un rūpniecības standartiem.

 

Doi: 10.1186/s 12934-022-01778-5