Membrānas tehnoloģija un vakcīnu precizēšana (Ⅰ)
Vakcīnas nāk no dažādiem avotiem, tostarp audu ekstraktiem, baktēriju šūnām, vīrusu daļiņām, olbaltumvielām un nukleīnskābēm, ko ražo zīdītāju rekombinantās šūnas, rauga un kukaiņu šūnas.
Visizplatītākā vakcīnas ražošanas metode ir balstīta uz sākotnējo fermentācijas procesu, kam seko attīrīšana. Vakcīnas ražošana ir sarežģīts process, kas ietver daudz dažādu posmu un procesu. Pareizas attīrīšanas metodes izvēle ir ļoti svarīga, lai sasniegtu vēlamo galaprodukta tīrību. Vakcīnu precizēšana ir svarīgs solis, kam ir būtiska ietekme uz produkta atgūšanu un turpmāko attīrīšanu. Vakcīnu precizēšanai var izmantot vairākas metodes. Savākšanas metodes un aprīkojuma izvēle ir atkarīga no akumulatora veida, savāktā produkta veida un procesa šķidruma. Šīs metodes ietver membrānas filtrēšanu (mikrofiltrāciju, tangenciālās plūsmas filtrēšanu), centrifugēšanu un dziļo filtrēšanu (normālas plūsmas filtrēšana). Pēc ilgstošas pieredzes vakcīnas ražas dzidrināšana parasti tiek panākta ar centrifugēšanu, kam seko dziļa filtrēšana.
Pēdējos gados uz membrānām balstītas metodes ir kļuvušas nozīmīgas vakcīnu precizēšanā. Iepriekšējos procesos arvien vairāk tiek izmantotas vienreizējās lietošanas tehnoloģijas, tāpēc ražas novākšanas stratēģijas ir jāmaina. Šajā rakstā sniegts visaptverošs pārskats par dažādām uz membrānām balstītām tehnoloģijām un to pielietojumiem vakcīnu precizēšanā.
01 Ievads
Vakcīnas ir būtiska mūsu infekcijas slimību profilakses sastāvdaļa, kas joprojām ir šokējošs nāves cēlonis. Ik gadu no 2 līdz 3 miljoniem cilvēku tiek izglābti no difterijas, stingumkrampjiem, garā klepus un masalām, pateicoties imunizācijai. Vakcīnas aptver plašu klāstu, sākot no maziem rekombinantiem proteīniem līdz veselām vīrusu daļiņām un veselām baktērijām. Tos var ražot dažādas sistēmas: olas, zīdītāju šūnas, baktērijas utt. Vakcīnu sarežģītības un daudzveidības dēļ pašlaik nav vispārpieņemta attīrīšanas protokola vai veidnes, lai gan pieaug interese par vakcīnu platformām.
Parasti vakcīnas procesu var iedalīt trīs daļās: iepriekšējā (ražošana un dzidrināšana), pakārtotā apstrāde (attīrīšana, tostarp ultrafiltrēšana, hromatogrāfija un ķīmiskā apstrāde) un formulēšana (galīgās uzpildes darbības). Neatkarīgi no ražošanas sistēmas dzidrināšanai (sākotnēja nevēlamo vielu atdalīšana) ir galvenā loma stabila attīrīšanas procesa noteikšanā. Pareiza dzidrināšanas darbība galvenokārt noņem veselas šūnas, šūnu atliekas, koloīdus un lielus agregātus, lai samazinātu pakārtotās apstrādes slogu. Dažos gadījumos dzidrināšana var samazināt arī nešķīstošos piemaisījumus, saimniekšūnu proteīnus (HCP) un saimniekšūnu nukleīnskābes. Tāpat kā jebkurš cits attīrīšanas posms, dzidrināšanas posms ir jāoptimizē, lai sasniegtu maksimālu produkta iznākumu un tīrību, vienlaikus pielāgojoties vakcīnas specifikai un ražošanas ierobežojumiem.
Vakcīnas veidu neviendabīguma dēļ dzidrināšanai tiek izmantotas dažādas metodes, tostarp centrifugēšana vai filtrēšana (1. tabula).
Lai sasniegtu vēlamo precizējumu, parasti ir nepieciešamas vairākas darbību sērijas. Pirmā darbība ir paredzēta lielāku daļiņu noņemšanai (primārā dzidrināšana), bet otrā darbība ir paredzēta koloīdu un citu submikronu daļiņu noņemšanai (sekundārā dzidrināšana). Zema ātruma centrifugēšana kalpo kā vienreizēja dzidrināšanas iespēja, ļaujot šūnas un šūnu atliekas noņemt ar nokrišņiem. Centrifugēšana var izturēt lielas cietās slodzes, un to plaši izmanto partijas vai nepārtrauktā režīmā un disku centrifūgās. Tam nepieciešami lieli kapitālieguldījumi un uzturēšanas izmaksas, un tas saskaras ar problēmām, palielinot mērogošanu, jo trūkst uzticama mēroga samazināšanas modeļa. Tomēr daži komerciāli vakcīnu ražotāji izmanto centrifūgas liela mēroga ražošanā, kas ietver lielus apstrādes apjomus un vairāk ražošanas darbību.
Dzidrināšanas filtrēšanu var veikt ar parastās plūsmas filtrēšanu (NFF, pazīstama arī kā strupceļa filtrēšana) vai tangenciālās plūsmas filtrāciju (TFF, kas pazīstama arī kā šķērsplūsmas filtrēšana). Ir arī īpaši filtru režīmi (dziļie filtri), kas satur pozitīvi lādētus materiālus un filtru AIDS, kas uzlabo šūnu atlieku, koloīdu un negatīvi lādētu nevēlamu komponentu aizturi.
Membrānas filtri aiztur daļiņas pēc izmēra izslēgšanas, un tiem nav augsta netīrumu aiztures spēja, tāpēc tie ir piemēroti sekundāriem dzidrināšanas posmiem. Gan dziļo filtru, gan membrānas filtrus ir viegli mērogot un ieviest (vienkāršs sistēmas dizains). Atšķirībā no NFF, TFF galvenokārt izmanto primārajai dzidrināšanai (mikrofiltrācijai). Membrānas ar robežvērtību 0.1-0.65 μm (vēlams ar atvērtu kanālu) ir veiksmīgi izmantotas, lai saglabātu šūnas, šūnu atliekas un citus lielus piesārņotājus. Lielākā daļa TFF aprīkojuma ir lineāri mērogojams un atkārtoti lietojams pēc tīrīšanas, kas ievērojami samazina izmaksas par palīgmateriāliem solim.
Dzidrināšanas posms atrodas starp augšupējiem un pakārtotajiem procesiem, un dažkārt tas tiek ignorēts vakcīnas procesa izstrādes laikā, jo laiks un resursi ir prioritāri citiem attīrīšanas posmiem, piemēram, hromatogrāfijai vai blīvuma gradienta centrifugēšanai.
Pat vakcīnu ražošanas procesu patenti bieži izlaiž precizēšanas posmu. Dzidrināšanas efektivitāte tieši ietekmē pakārtotā procesa darbību. Slikti optimizēts dzidrināšanas posms var negatīvi ietekmēt sterilizētā filtra ietilpību vai saīsināt hromatogrāfisko sveķu kalpošanas laiku. Mūsdienās stingrākas regulējuma prasības liek vakcīnu ražotājiem ražot tīrākas, labi raksturotas, bet pieejamas vakcīnas. Šajā gadījumā katram solim ir jāpievērš pienācīga uzmanība. Pašreizējās tendences liecina, ka augšupējais process virzās uz "tīrāku" ekspresijas sistēmu (ti, šūnas, kas kultivētas bez seruma barotnēs, aizstāj olas) ar paaugstinātu produktivitāti un lielāku šūnu blīvumu.
Pakārtotie attīrīšanas procesi tiek vienkāršoti un racionalizēti, lai palielinātu galaprodukta tīrību. Lai veiktu šīs izmaiņas, precizēšanas solis nevar kļūt par vājo vietu. Šajā gadījumā filtrēšanas tehnoloģija atbilst jaunam precizēšanas izaicinājumam, risinot jautājumus par palielinātu procesa elastību, vienreizējas lietošanas iespēju un samazinātām investīciju izmaksām.
02 Vīrusu vakcīnu precizēšana
Vairāku veidu dzidrināšanas metodes, atsevišķi vai kombinācijās, ir veiksmīgi izmantotas, lai noskaidrotu ražu vakcīnu barības beigās.
Pilotmērogi:1-20L, ražošanas apjoms: vairāk nekā 20L
2.1. Piesardzības pasākumi vīrusu vakcīnas precizēšanai
Daudzas vakcīnas satur visas vīrusa daļiņas vai daļu no tām, lai veidotu imunitāti pret vīrusu infekciju. Tos parasti iedala četrās plašās kategorijās:
Dzīva novājināta vakcīna (LAV), kuras pamatā ir novājināts vīrusa celms, lai samazinātu tā virulenci. Vājināti vīrusi var vairoties organismā, bet nav patogēni.
- Inaktivētu vīrusu (IV) vakcīnas, kas satur ķīmiski vai ultravioleti inaktivētus vīrusus, lai novērstu inficēšanos. Vīrusa daļiņas var būt pilnīgas, sadalītas vai attīrītas (tikai antigēnas olbaltumvielas).
- Vīrusu vektora (VV) vakcīna ir aktīvs, nepatogēns vīruss, kas prezentē patogēna vīrusa antigēnu. Šīs nesen izstrādātās struktūras tiek izmantotas arī gēnu terapijas lietojumos.
Vīrusu tipa daļiņu (VLP) vakcīnas, īpaša vīrusu apakšvienību vakcīnu klase, kas atdarina vīrusu daļiņu kopējo struktūru, bet nesatur infekciozu ģenētisko materiālu.
Vairumā gadījumu vīrusa daļiņas ir pilnīgi neskartas dzidrināšanas posmā, pat vīrusu vakcīnas līzes laikā (šķelšanos parasti veic pa straumi, attīrītākā vidē).
Galvenais vīrusu noskaidrošanas izaicinājums ir augstas ražības vīrusu daļiņu atgūšana, vienlaikus efektīvi noņemot šūnu atliekas, lielus agregātus un nešķīstošus piesārņotājus. Kā aprakstīts nākamajās sadaļās, ir vairāki faktori, kas var izraisīt vīrusa degradāciju vai zudumu. Turklāt vīrusa iznākumu var būt grūti paļauties, jo šajā procesa posmā vīrusu kvantitatīvās noteikšanas metodes ir ļoti mainīgas, īpaši LAV un VV vakcīnām. Šīm vakcīnām vīrusu iznākumu bieži novērtē, izmantojot infekciozitātes testus, piemēram, aplikuma testu vai TCID 50 testu. Fakts, ka daži no iegūtajiem savienojumiem var traucēt vīrusa spēju inficēt indikācijas šūnas, palielina šīs kvantitatīvās pieejas mainīgumu.
2.2. Vīrusu vakcīnas noskaidrošanas stratēģija
Vīrusu vakcīnas ļoti atšķiras pēc izmēra, struktūras, formas un ekspresijas sistēmām (3. tabula).
Tā rezultātā parasti nav veidnes tās pakārtotajiem procesiem, jo īpaši precizēšanas posmiem. Teorētiski visas pieejamās metodes (zema ātruma centrifugēšana, mikrofiltrēšana TFF, NFF) var atlasīt un potenciāli kombinēt, lai notīrītu vīrusu. Faktiski dzidrināšanas metožu panākumus ietekmē iesaistīto vīrusu ekspresijas sistēma un fizikāli ķīmiskās īpašības.
Recently, the high cell density process of viral vaccines is being explored. High cell density processes add to the challenge of clarification. Many treatment methods are by preconditioning, i.e. polymer-induced flocculation, precipitation, alternating TFF, etc. For example, Tomic et al. describe a method for high cell density collection (>{{0}} šūnas /ml) dzidrināšanas metode, izmantojot katjonu polimērus, samazināja dziļās filtrācijas laukumu 4 reizes, salīdzinot ar tradicionālajām metodēm. Šis paņēmiens ļauj novākt lielas ietilpības fermentatorus, neizmantojot centrifūgas. Tāpat Riske et al. parādīja, ka 40 l šūnu kultūru (0,02%), kas satur 1.4-2.6% cietvielu, apstrāde ar hitozānu izraisīja absolūtā filtra kapacitātes palielināšanos 7-kārtīgi pēc dziļās filtrēšanas.
Viņi arī piemin, ka hitozāns, šķiet, uzlabo dzidrināšanas efektivitāti, flokulējot submikronu daļiņas, kas parasti nogulsnējas centrifūgās. Priekšapstrāde un flokulācijas metodes, visticamāk, arī turpmāk būs daļa no turpmākajiem vakcīnu filtrēšanas precizējumiem. Penetranti, tostarp cukuri, glikoli un aminoskābes, galvenokārt flokulē vīrusus. Vīrusu flokulāciju ar osmotisko šķīdumu, kam seko 0.2µ mikrofiltrācija, var izmantot kā visaptverošu vīrusu attīrīšanas procesu. Penetranti var stimulēt vīrusu agregāciju, samazinot hidratācijas slāni ap daļiņām, lai flokulētu hidrofobas neiekapsulētas vīrusa daļiņas un iekapsulētas vīrusu daļiņas. Lai gan ir pierādīts, ka penetranti flokulē vīrusus, šī metode var kļūt par platformu turpmākai vakcīnu attīrīšanai, un tās iespējamība izmēģinājuma vai liela mēroga vakcīnu attīrīšanā nav pierādīta. Flokulācijas pirmapstrādes metode, kas, visticamāk, arī turpmāk būs daļa no turpmākās vakcīnas filtra dzidrināšanas, tiek veikta 2L fermentatorā. Lai šīs metodes varētu izmantot liela mēroga ražošanas operācijās, tās ir jāvalidē izmēģinājuma un ražošanas mērogā.
2.2.1. Sistēmas ietekmes izteikšana
Dzidrināšanas metode galvenokārt ir atkarīga no iepriekšējā procesa veida un ekspresijas sistēmas, kas nosaka noņemamo piesārņotāju veidu un līmeni. Vīrusu vakcīnas parasti ražo vistu embrijos, izmantojot nepārtrauktas zīdītāju vai putnu šūnu līnijas vai bakulovīrusa/kukaiņu šūnas, kas ir sarežģītāka ekspresijas sistēma. Dažus VLP veidus var ražot arī citas heterologas ekspresijas sistēmas (baktērijas, raugs, augu šūnas).
2.2.1.1. Vīruss, kas ražots vistas embrijā
Vakcīnas ir ražotas olās gadu desmitiem. Šis darbs ir datēts ar 1931. gadu, kad Vudrafs un Good Pasture veiksmīgi izmantoja auglīgo olu horio-alantoisko membrānu kā substrātu vīrusu augšanai. Mūsdienās daudzas cilvēku un veterinārās vakcīnas joprojām tiek ražotas, izmantojot šo seno procesu. Vispazīstamākā, iespējams, ir sezonālās gripas vakcīna. Princips ir inokulēt vistu olas ar interesējošiem vīrusiem un pēc tam replicēties horio-alantoīnajā membrānā. Pēc reprodukcijas tiek savākts un attīrīts alantoiskais šķidrums, kas bagāts ar vīrusu daļiņām.
Alantoīda šķidrums ir sarežģīta dzidrināšanas barība. Tā augstais minerālvielu un olbaltumvielu saturs (tostarp ovalbumīns) nodrošina augstu viskozitāti. Alantoiskā šķidrumā ir arī būtiski audu savienojumi no vistu embrijiem, piemēram, spalvas, knābji, asinsvadi vai asins šūnas. Lielā cietvielu satura dēļ primārajai dzidrināšanai ieteicamā iespēja ir zema ātruma centrifugēšana, kas parasti nodrošina aptuveni 70 % atgūšanas. Tomēr ir iespējama arī primārā dzidrināšana, izmantojot filtrēšanas metodes. Attiecībā uz NFF polipropilēna un celulozes dziļajiem filtriem ir labas alantoiskā šķidruma savākšanas iespējas. Virsmas filtri, kas izgatavoti no polipropilēna vai celulozes bāzes dziļajiem filtriem, var būt ar ietilpību 150-210 l/m², un tie var samazināt padeves plūsmas duļķainību līdz pat 3 reizēm. Atvērtā padeves kanāla TFF ierīce ir piemērota arī alantoiskā šķidruma dzidrināšanai, jo ierīce ir vairāk piemērota minimālam spiediena zudumam caur padeves kanālu, tādējādi samazinot kanālu bloķēšanu.
Sekundāro dzidrināšanas soli var viegli veikt ar NFF. Polipropilēna, celulozes un stikla šķiedras materiālu kombinācija parasti uzrāda labu efektivitāti, un alternatīva sekundārajai dzidrināšanas posmam ir izmantot TFF un {{0}},65 μm vai 0,45 μm mikrofiltrācijas membrānas ierīci un darbināt osmotisko plūsmu. kontrole. Šajā darbībā var izmantot atvērtā kanāla TFF ierīci ar hidrofilu PVDF vai hidrofilu PES membrānu.
Ir svarīgi atzīmēt, ka vīrusu daļiņas var būt saistītas ar nešķīstošu gružu materiālu, kas dzidrināšanas laikā var ievērojami samazināt vīrusu veidošanos. Sāls šķīduma izmantošana var samazināt šo saistību starp gripas vīrusiem un cietajiem fragmentiem, kā rezultātā ražošanas apjoms palielinās aptuveni divas reizes, neietekmējot vīrusa daļiņu integritāti.
2.2.1.2. Vīrusi, kas ražoti secīgās zīdītāju un putnu šūnu līnijās
Nesen dažas vīrusu vakcīnas ir pārcēlušās no procesiem, kuru pamatā ir olšūnas, par labu procesiem, kuru pamatā ir šūnu kultūra (īpaši attiecībā uz gripas vakcīnām). Galvenais šīs pārejas iemesls ir novērst ar embriju olām saistītas vakcīnu ražošanas problēmas (ti, olu piegādes trūkumu, kas var rasties jebkura mājputnu slimības uzliesmojuma gadījumā). Tā rezultātā pašlaik tiek izstrādātas daudzu veidu vakcīnas un vīrusu vektori, izmantojot nepārtrauktas šūnu līnijas no zīdītājiem vai putniem, parastās šūnu līnijas (piemēram, Vero, MDCK vai HEK293 šūnu līnijas) vai patentētas šūnu līnijas.
Atkarībā no ekspresijas sistēmas vīruss var palikt šūnā, kam nepieciešams šūnu līzes posms, vai arī tas var palikt ārpus šūnas (līze vai pumpuru veidošanās). Cietā slodze un šķīstošais saturs, kas iegūts no šūnu kultūras, ir daudz tīrāks nekā alantoiskā šķidrā fāze. Līdz ar to NFF tehnoloģiju ir vieglāk ieviest, un jauda ir ievērojami lielāka. Tomēr filtrēšanas jauda ir ļoti atkarīga no šūnu kultūras apstākļiem, piemēram, šūnu blīvuma vai šūnu dzīvotspējas novākšanas laikā. Šie parametri ietekmē šūnu atlieku un makroagregātu daudzumu, kas var aizsprostot dziļos filtrus un membrānas, kā rezultātā samazinās jauda.
Thomassen et al ir labs NFF precizēšanas piemērs. Izmanto inaktivētā poliovīrusa (IPV) ražošanas procesā. Vero šūnas, kas kultivētas uz mikronesējiem, tika izmantotas vīrusu proliferācijai ar šūnu blīvumu {{0}},78 x 106 šūnas/ml TOI. Iepriekšējai dzidrināšanai tiek izmantots 75 μm nerūsējošā tērauda siets, lai no ražas noņemtu mikronesējus. Divslāņu šķirošana tiek dzidrināta, izmantojot blīvuma dziļo filtru (0.2-2,0 μm), kam seko sterilizēta kvalitātes filtrs.
Izvēlētā mērogojamā vienreizējās lietošanas vienība tika veiksmīgi izmantota Sabin IPV klīniskā pētījuma materiāla sagatavošanai 350 L mērogā. Atkarībā no vīrusa serotipa tiek iegūts vīrusa atkopšanas līmenis no 86 līdz 96 procentiem.
2.2.1.3. Bakulovīrusam/vīrusiem līdzīgas daļiņas, kas ražotas kukaiņu šūnu sistēmā
Bakulovīrusu/kukaiņu šūnu sistēmu apsvēršana liela mēroga vakcīnu ražošanai ir salīdzinoši jauna, taču tā izraisa arvien lielāku interesi par vīrusu vektoru un VLP jomā. Šīs sistēmas galvenais ieguvums ir tas, ka tā ietver īslaicīgu (nav nepieciešams izveidot šūnu līnijas) un drošu (nav pilnīgas vīrusa DNS) ražošanu. Ir arī daži trūkumi, piemēram, nepieciešamība pēc bakulovīrusa noņemšanas un produkta stabilitātes.
Cervarix, VLP vakcīna pret cilvēka papilomas vīrusa infekciju, ko ražo GlaxoSmithKline, ir pirmā cilvēku vakcīna, kas ir komerciāli ražota kukaiņu šūnās. Pašlaik tiek izstrādātas vairākas vakcīnas, kuru pamatā ir VLP un rAAV vektori, kas ražoti ar bakulovīrusu inficētām kukaiņu šūnām. Visbiežāk tiek izmantotas kukaiņu šūnu līnijas, kas iegūtas no rudens bruņtārpiem Spodoptera frugiperda (Sf9 un Sf21) un kāpostu smilga Trichoplusia ni (BTI-TN5B1-4 šūnas), jo tās spēj augt suspensijā, kas vienkāršo augšteces pastiprināšanu. process. Pēc augšanas līdz vēlamajam dzīvo šūnu blīvumam šīs šūnas tiek inficētas ar rekombinanto bakulovīrusu eksponenciālās šūnu augšanas fāzē proteīnu ekspresijai. Lielais bakulovīrusu genoms ļauj ekspresēt piecus vai vairāk dažādus proteīnus, kas atbilst VLP un vīrusu vektoru sarežģītībai.
Bernards u.c. aprakstīja kukaiņu šūnu kultūras pakārtoto procesu. Process ir ļoti mainīgs, atspoguļojot ar šo metodi ražoto olbaltumvielu daudzveidību. Pirmo attīrīšanas secības soli lielā mērā ietekmē bioreaktora tilpuma raksturlielumi (ti, šūnu blīvums un dzīvotspēja) vai produkta izdalīšanās veids (izdalās pumpuru veidošanās vai šūnu līzes rezultātā). Kukaiņu šūnu bakulovīrusa infekcija var izraisīt šūnu līzi 3-5 dienu laikā. Šūnu iznīcināšana var izraisīt proteolītiskās aktivitātes palielināšanos un citus vides faktorus, kas var izraisīt rekombinanto proteīnu degradāciju.
Ir bijuši mēģinājumi izstrādāt bakulovīrusus ar mazāku spēju ierosināt šūnu līzi. Bakulovīruss iznīcina mazāk nekā 10 procentus inficēto kukaiņu.
Šūnu līzi var veikt, izmantojot dažādas metodes, piemēram, sasaldēšanu-atkausēšanu, mazgāšanas līdzekļus, homogenizatorus vai ultraskaņas apstrādi. Kukaiņu šūnām nav šūnu sienas, un tāpēc tās ātri izšķīst. Lai gan ir ziņots par ultraskaņas apstrādi daudzos stenda procesos, to reti izmanto eksperimentālā vai komerciālā mērogā. Visizplatītākā metode ir izmantot homogenizatoru, lai iznīcinātu šūnas zemas koncentrācijas mazgāšanas līdzekļa (0.1% Triton X-100 vai NP-40) klātbūtnē. Mazgāšanas līdzekļu izmantošana un mikrofluidizācija vai osmotiskā trieciena homogenizācija ir veiksmīgi izmantota daudzos liela mēroga ražošanas procesos. Parasti kukaiņu šūnas tiek suspendētas līzes buferos (50 mM TRIS pH7,7, 300 mM NaCl, 5% glicerīns, 0,2 mM PMSF un proteāzes inhibitori), kuru laikā Triton-X100 tiek pievienots līdz galīgajai koncentrācijai 0,1%, kam seko viegla ultraskaņa vai mikrofluidizācija. Pēc tam maisījumu centrifugē, lai noņemtu nešķīstošās daļiņas.
Šajā posmā lizāts var izskatīties ļoti duļķains, un to ir grūti filtrēt, izmantojot 0,45 μm filtru. Dažreiz pirolīzes dzidrināšanas posmā var novērot zudumus līdz 30%. Benzoenzīmu pievienošana šķelšanās stadijā palīdz atrisināt filtrēšanas problēmu. Šūnu tīrīšana ar fosfātu buferētu sālījumu pēc novākšanas un ātra "sasaldēšana-atkausēšana" augsta sāls daudzumā (500 mM NaCl), kas satur krekinga buferi, palīdz noņemt agregātus.
Kukaiņu šūnu radīto VLP un vīrusu vektoru noskaidrošana notiek pēc šūnu līzes (ķīmiskas vai mehāniskas apstrādes rezultātā), kas atbrīvo ne tikai vīrusu daļiņas, bet arī lielu daudzumu šūnu nukleīnskābes. Kukaiņu šūnas spēj augt ar lielu šūnu blīvumu, sākot no 1-9.10 6 šūnām/ml. Tāpēc dzidrināšanas posmā būtu jāattiecas uz augstu šūnu blīvumu, augstu nukleīnskābju saturu un, ja iespējams, bakulovīrusa daļiņu noņemšanu. Lai padarītu lietas sarežģītākas, VLP vai vīrusu vektoriem un bakulovīrusiem var būt līdzīgi izmēri (bakulovīrusi ir 60-80 nanometrus plati un 300-400 nanometrus gari). Augstā šūnu blīvuma dēļ centrifugēšana ir bijusi vēlamā metode primārajai dzidrināšanai gadu desmitiem. Tomēr šķiet, ka membrānas procesi ir ļoti pievilcīga alternatīva, jo mērogojamību ir viegli definēt.
Dziļie filtri ir efektīvi izmantoti trīsslāņu rotavīrusam līdzīgu daļiņu pakārtotajā procesā. Laboratorijas līmenī šo sarežģīto daļiņu attīrīšanai bieži izmanto CsCl blīvuma gradienta ultracentrifugēšanas metodi. Pētnieki novērtēja ne tikai dziļā filtra dzidrināšanas posmu, bet arī visu pakārtoto procesu (Triton X-100 šķelšanos un dziļo filtrēšanu, kam sekoja ultrafiltrācija un daļiņu izmēra izslēgšana). Rezultāti liecina, ka CsCl blīvuma gradienta iznākums var sasniegt 37%.
Ultracentrbēdzes metode ir aptuveni 10%. Kā vēl viens piemērs, lai atgūtu un koncentrētu HIV līdzīgas daļiņas, kas ražotas kukaiņu šūnās, tika izmantotas 0, 45 μm dobas šķiedras un 500 kDa smalka diametra šķiedras. Šajā pētījumā dobu šķiedru bīdes spēks tika optimizēts, pamatojoties uz šūnu integritāti. Rezultāti Tika izveidots zema bīdes spēka process, lai aizstātu galda cukura gradienta ultracentrifugēšanu.
Šo procesu var izmantot masveida ražošanā. Dziļie filtri ir veiksmīgi izmantoti arī rekombinanto adeno saistītu vīrusu ražošanā. Šūnu līze tika veikta ar divu virzuļu mehānisko šūnu traucētāju, kam sekoja nukleāzes apstrāde. Dzidrināšanas posmā tika izmantots 1,2 μm stikla šķiedras dziļā filtra elements, kam sekoja divi slāņi 0,8 μm hidrofilā PES un 0,2 μm hidrofilā PES. Proporcionāla izmēra filtri tiek izmantoti apstrādes partijām no mazākām līdz 200 L izmēriem. Ir veiksmīgi izmantoti dziļie filtri, un ir ziņots, ka ļoti efektīvi ir arī TFF reitingi ar plakanām plēvēm vai dobām šķiedrām 0,2 µm vai 0,45 µm.
Tecnologica (IBET) pētījumā Oeiras Eksperimentālās bioloģijas institūtā Portugālē tika izmantots NFF, lai bez centrifugēšanas veiktu bakulovīrusu ekspresēto C hepatīta VLP noskaidrošanu. Lai precizētu VLP ražas novākšanu, tiek izmantoti nominālie polipropilēna filtri (10,5,0.6 un 0.3μm). VLP savākšanas centros filtrēšanai tiek izmantoti tie paši filtri ar 0,6 μm un 0,3 μm porām. Visi pētītie filtrāti tika pārbaudīti attiecībā uz HCV-VLP atgūšanas ātrumu un tika salīdzinātas ieteicamās filtrēšanas metodes. Rezultāti ir parādīti 4. tabulā.
Rezultāti parādīja, ka 5 μm-0,3 μm filtram bija visaugstākā produkta atgūšana (100%) tieši novāktai C hepatīta VLP barībai. Polipropilēna 0,6 μm filtram bija visaugstākā produkta atgūšana (82%) centrālajai barībai, un saimniekšūnas DNS klīrenss bija aptuveni 70%.
2.2.1.4. Vīrusiem līdzīgas daļiņas, kas rodas baktēriju vai rauga sistēmās
Baktēriju vai rauga sistēmās ekspresēto VLP vakcīnu dzidrināšanas metodes veids ir atkarīgs no VLP izdalīšanās ārpusšūnu mediatoriem. Ja VLP nevar izdalīt efektīvi, pirms faktiskā dzidrināšanas posma var būt nepieciešama šūnu līze vai citas ekstrakcijas darbības. Lai gan šis ir zelta standarts proteīnu dzidrināšanas nozarē, centrifugēšana (nepārtraukta vai sērijveida), kas izteikta baktēriju vai rauga sistēmās, pēdējā laikā membrānas procesi ir kļuvuši par ļoti pievilcīgu alternatīvu, pateicoties to vieglai mērogojamībai un savietojamībai ar vienreizējas lietošanas ierīcēm. ārstēšanu.
Rihters un Topels skaidro centrifugēšanas, TFF vai abu kombinācijas izmantošanu, sagatavojot VLP, kas ražotas dzidrinātajā E. coli. Viņu darbā tika izmantotas 0,45 m TFF membrānas, lai atšķaidītu un dzidrinātu homogenizētos E. coli homogenātus 5 grādu temperatūrā. Viņi arī atzīmē, ka TFF uz membrānas bāzes ir piemērots augstas viskozitātes ražas apstrādei, vēlams, izmantojot TFF vienības ar atvērtu kanālu konfigurācijām.
Centrbēdzes dzidrināšana ir novērtēta arī kā alternatīva TFF. Šajā gadījumā iegūtais homogenāts netika atšķaidīts un centrifugēts 4 grādos 105 minūtes, 10000g. Nepārnesot mīksto pārklājumu, supernatants tika izliets no daļiņām un atkārtoti centrifugēts 4 grādos un 10 000 g 60 minūtes. Pēc tam supernatants tika noņemts no esošajām daļiņām, atšķaidīts ar EB buferšķīdumu (43,89 mM Tris HCl, 6,11 mM Tris bāzes, 5,0 mM EDTA, 10% (v/v) Triton X-100) 1:2 un filtrēts. uz 0,22 m sterila filtra ierīces. Turpmāka apstrāde. Tiek ziņots, ka palielināšanas process šīs VLP vakcīnas ražošanai E. coli 800 l mērogā arī tika noskaidrots, apvienojot centrifugēšanu un TFF.
Rekombinantā E hepatīta vakcīna HEV 239 ir licencēta Ķīnā, lai imunizētu pieaugušos no 16 gadu vecuma. Vakcīnas antigēni (VLP) tiek ekspresēti E. coli, un ir pierādīts, ka antigēna ražošanas procesa mērogs ir 50L. Produkts tika ekstrahēts, krekinga E. coli, un ieslēguma ķermeņi tika atdalīti no šūnu fragmentiem, intensīvi mazgājot ar buferšķīdumu, kas satur 2% Triton X-100, un pēc tam izšķīdināja ar 4 M urīnvielas homogenizatoru. TFF precizē cilvēka papilomas vīrusa VLP, kas ražots Saccharomyces cerevisiae (15L). Šūnu lizāts, kas apstrādāts ar nukleāzi, tika notīrīts ar šķērsplūsmas mikrofiltrāciju transfiltrācijas režīmā, izmantojot 0, 65 μm dobu šķiedru filtru. Tas pats process tiek izmantots vakcīnu ražošanā. Lai gan tikai nedaudzas uz VLP balstītas vakcīnas ir sasniegušas komerciālu mērogu, tiek izstrādātas vairākas uz VLP balstītas vakcīnas, no kurām lielākā daļa tiek attīrīta, izmantojot centrifugēšanas vai membrānas tehnoloģiju.
Kosmosa ietekmes ierobežots, nākamajā nodaļā dalīsimies ar satura otro pusi. Nākamajā rakstā mēs dalīsimies ar dažiem vakcīnas precizēšanas un attiecīgo membrānas komponentu izmantošanas gadījumiem.
Kā pirmais uzņēmums lokalizācijas ķēdē Guidling Technology ir uzkrājis pietiekamu atbilstošu pieredzi vakcīnu noskaidrošanā. Guidling Technology ir izstrādes un ražošanas uzņēmums, kas koncentrējas uz biofarmaceitisko un šūnu kultūru, attīrīšanu un atdalīšanu. Produkti tiek plaši izmantoti biomedicīnā, diagnostikā, rūpnieciskā šķidruma filtrēšanas, noteikšanas, dzidrināšanas, attīrīšanas un koncentrēšanas procesā; Guidling ir veiksmīgi izstrādājis ultrafiltrācijas centrifūgas cauruli, ultrafiltrācijas/mikrofiltrācijas membrānas kaseti, vīrusu noņemšanas filtru, tangenciālās plūsmas filtra ierīci, dziļo membrānu skursteni utt., kas pilnībā atbilst biofarmaceitiskās un šūnu kultūras pielietojuma scenārijiem.
Mūsu membrānas un membrānfiltrus plaši izmanto priekšfiltrācijas, mikrofiltrācijas, ultrafiltrācijas un nanofiltrācijas koncentrēšanai, ekstrakcijai un atdalīšanai. Mūsu plašais produktu līniju klāsts, sākot no mazas vienreizējas lietošanas laboratorijas filtrēšanas līdz ražošanas tipa filtrēšanas sistēmām, sterilitātes pārbaudei, fermentācijai, šūnu kultūrai un citiem, var apmierināt testēšanas un ražošanas vajadzības.