Īsa diskusija par vairākām unikālām dobu šķiedru metodēm iekļaušanas ķermeņa attīrīšanā

Iekļaušanas ķermeņi (IB) ir augsta blīvuma nešķīstošās proteīna daļiņas, kas ietītas membrānās, kas veidojas, kad svešie gēni tiek ekspresēti prokariotu šūnās, īpaši Escherichia coli. Novērojot mikroskopā, IB ir augstas refrakcijas reģions, kas acīmredzami atšķiras no citiem citoplazmas komponentiem.

Iekļaušanas ķermeņa veidošanās ir salīdzinoši sarežģīta, saistīta ar proteīna veidošanās ātrumu citoplazmā, jaunizveidoto peptīdu koncentrācija ir augsta, un nav pietiekami daudz laika, lai salocītu, lai veidotos amorfi olbaltumvielu agregāti. Iekļaušanas ķermeņi pamatā sastāv no olbaltumvielām, no kurām vairāk nekā 50% ir klonēti produkti. Šo produktu primārā struktūra ir pilnīgi pareiza, bet trīsdimensiju konfigurācija ir nepareiza, tāpēc nav bioloģiskas aktivitātes. Ieslēguma ķermeņa izmērs ir 05-1μm, nešķīst ūdenī, šķīst tikai denaturatoros, piemēram, urīnviela, guanidīna hidrohlorīds utt.

E. coli ieslēguma ķermeņi var atrasties divās šūnas vietās: citoplazmā un perifērajā citoplazmā. Iekļaušanas ķermeņu atrašanās vieta un īpašības šūnā ir atkarīgas no tā, kā tiek ekspresēti proteīni.

E. coli citoplazmā esošo ieslēgumu diametrs parasti svārstās no {{0}},2 līdz 1,5 μm, un dažādiem proteīniem ir atšķirīgs diametrs, piemēram, interferona izmērs ir 0,811 μm un prorennet ir 1,281 μm. Dažos gadījumos dažu ieslēgumu ķermeņu diametrs ir lielāks par E. coli diametru, kas rada E. coli izvirzījumu. Kopumā šūnai ir tikai viens ieslēguma ķermenis.

 

Iekļaušanas ķermeņa attīrīšana

 

Iekļaušanas ķermeņa attīrīšanas process parasti ir:

Šūnu sasmalcināšana:

Šūnu sasmalcināšanas vispārējā tehnoloģija ir: ātrgaitas audu sasmalcināšana, stikla homogenizatora homogenizācija, ultraskaņas apstrāde, atkārtota sasaldēšanas-atkausēšanas metode, ķīmiskā apstrāde (parasti izmantojot lizocīma apstrādi).

 

Iekļaušanas ķermeņa mazgāšana:

Iekļaušanas ķermeņi ir neaktīvas cietas daļiņas, kas veidojas, intracelulāri aglutinējot olbaltumvielas, ko ekspresē baktērijas, kas parasti pastāv amorfā, nešķīstošā formā. Iekļaušanas ķermenī patiesais mērķa proteīns veido tikai aptuveni 50%, bet pārējais satur lipīdus, lipopolisaharīdus, nukleīnskābes un heteroproteīnus, kas ir saistīti ar ieslēguma ķermeni un ietekmē ieslēguma ķermeņa proteīna renaturāciju. Tāpēc mazgāšana pirms denaturēšanas ir ļoti nepieciešams solis.

Turklāt iekļaušanas ķermeņu mazgāšana palīdz palielināt rekombinanto proteīnu pārlocīšanas ražu. Noņemot piemaisījumus, var samazināt šķēršļus renaturācijas procesā, lai proteīnu varētu efektīvāk salocīt un pareizi salikt, tādējādi uzlabojot proteīna aktivitāti un funkciju‌.

Mazgāšanā parasti izmanto mazāk nekā 1% neitrāla mazgāšanas līdzekļa, piemēram, Tween, Triton, Urea un NP40 plus EDTA un reducējošās vielas 2-merkaptotreitolu (DTT), -merkaptoetanolu atkārto daudzas reizes, jo mazgāšanas līdzekļa mazgāšanas jauda ir uzlabota ar šķīduma jonu stipruma palielināšanās, ieslēguma ķermeņu mazgāšanā var pievienot NaCl, lai palielinātu jonu stiprumu.

Iekļaušanas ķermeņus var izmantot, lai noņemtu citus šūnu sadalīšanās šķīduma komponentus, centrifugējot vai filtrējot, un abi izmanto iekļaušanas ķermeņu atšķirīgās fizikālās īpašības.

 

Centrifugēšana:

Iekļaušanas ķermeņa olbaltumvielas ir daudz blīvākas nekā tāda paša tilpuma šūnu fragmenti, tāpēc ieslēguma ķermeni var atdalīt no pārējās šūnas ar centrifugēšanas palīdzību. Nepārtrauktā centrifugēšana ir visbiežāk izmantotā darbība ieslēguma ķermeņu iegūšanai rūpnieciskajā ražošanā. Tā kā šūnu fragmentu blīvums ir mazāks nekā ieslēguma ķermeņa blīvums, sedimentācijas ātrums ir mazāks nekā ieslēguma ķermeņa blīvums. Nepārtraukta suspensija un centrifugēšana var centrifugēt lielāko daļu ieslēguma ķermeņa, kamēr šūnu fragmenti tiek pakāpeniski noņemti.
Filtrēšana (tangenciālās plūsmas filtrēšana): ieslēguma ķermeņu un šķīstošo proteīnu dažādo molekulāro izmēru dēļ var izmantot filtrēšanas metodi, kas var samazināt darbības izmaksas un atvieglot mērogošanu. Tangenciālās plūsmas filtrēšanu (TFF) virza transmembrānas spiediena starpība. Vielas un piemaisījumi, kas ir mazāki par membrānas poru izmēru, iziet cauri membrānai, savukārt piemaisījumi, piemēram, šūnas ar lielākām daļiņām, tiek notverti. Membrānas atvērums, ko parasti izmanto filtrēšanas mazgāšanai, ir 0,1 μm. Dobu šķiedru tangenciālās plūsmas mikrofiltrācija var tieši tikt galā ar lielu šķidrā materiāla cieto saturu, mazāk darbību, vienkāršu darbību, membrānu var atkārtoti izmantot tīrīšanas laikā, samazinot ieguldījumus iekārtās un ekspluatācijas izmaksas, saskaņā ar modulārās automatizētās ražošanas prasībām.

 

Tālāk ir sniegts pielietojuma gadījums iekļaušanas korpusa mazgāšanai, izmantojot Guidling dobās šķiedras kolonnas.

Mēs izmantojām 94 cm2 0.1-0,45 μm dobu šķiedru, lai koncentrētu 250 mL šķidruma (mērķa proteīna molekulmasa 17 kd). Visā mazgāšanas procesā tika pētīts mērķa proteīna atgūšanas ātrums un membrānas plūsmas samazināšanās.

0-71min ir koncentrēšanas process, 71-224min ir mazgāšanas un filtrēšanas process. Visa mikrofiltrācijas procesa laikā TMP pakāpeniski palielinājās, šķidruma ieplūdes ātrums nemainījās, un vidējā materiāla plūsma bija 12LMH.

Rezultāti parādīja, ka mērķa proteīns bija pilnībā notverts, un mērķa proteīna atgūšanas ātrums bija vairāk nekā 90%. Vadošās dobās šķiedras kolonnas ir stabilas un piemērotas šim lietojumam.

 

Iekļaušanas ķermeņa izšķīšana:

Ieslēguma ķermeņi parasti tiek izšķīdināti denaturējošā aģenta urīnvielas vai guanidīna hidrohlorīda apstākļos, un izšķīdinātie ieslēguma ķermeņa proteīni ir pilnībā denaturēti, tas ir, izņemot primāro struktūru un kovalentās saites, visas ūdeņraža saites un hidrofobās saites tiek iznīcinātas un hidrofobās. sānu ķēdes ir pilnībā atklātas.

Urīnviela un guanidīna hidrohlorīds ir vidēja stipruma denaturanti, kurus viegli noņemt ar dialīzi un ultrafiltrāciju. Vispārējā urīnvielas koncentrācija 8-10M, guanidīna hidrohlorīds 6-8M. Karbamīda šķīdināšanai ir priekšrocības: nejonizācija, neitrāla, zemas izmaksas, proteīna noņemšana pēc renaturācijas neizraisīs lielu daudzumu olbaltumvielu nogulsnēšanās, un izšķīdušos ieslēguma ķermeņus var attīrīt ar dažādām hromatogrāfijas metodēm, tāpēc tas ir plaši izmantots. .

 

Iekļaušanas ķermeņa olbaltumvielu pārlocīšana:

Izšķīdušajam rekombinantajam proteīnam jābūt pareizi salocītam, lai izveidotu funkcionālu proteīnu. Renaturācijas paņēmieni ietver proteīna šķīduma atšķaidīšanu līdz gandrīz neitrālam, denaturanta atdalīšanu, renaturēšanu kolonnā un gēla filtrēšanas hromatogrāfiju. Tostarp proteīna šķīduma atšķaidīšana līdz gandrīz neitrālam un denaturanta noņemšana ir izplatīta klasiskā renaturācijas metode, jo īpaši atšķaidīšanas renaturācijas metodei ir visaugstākais izmantošanas līmenis.

Denaturantu noņemšana:

Dialīze: Priekšrocība ir tāda, ka tilpums nepalielinās, un denaturanta atdalīšanas ātrums tiek kontrolēts, pakāpeniski samazinot ārējā caurlaidīgā šķidruma koncentrāciju, taču tas aizņem ilgu laiku un viegli veido neaktīvus olbaltumvielu agregātus, kas nav piemēroti liela mēroga darbība, un to nevar attiecināt uz ražošanas apjomu.

Ultrafiltrācija (TFF): viegli kontrolēt dialīzes ātrumu gan pētniecībā un attīstībā, gan izmēģinājuma testā vai ražošanā, var noņemt denaturantus (šķidruma maiņa + koncentrācija), izmantojot ultrafiltrāciju (TFF).

 

Iekļaušanas ķermeņa olbaltumvielu attīrīšana:

Olbaltumvielu attīrīšanas metodes pēc renaturācijas ir līdzīgas šķīstošo olbaltumvielu attīrīšanas metodēm, proti, jonu apmaiņas hromatogrāfija, gēla filtrācijas hromatogrāfija, afinitātes hromatogrāfija, amonija sulfāta izsāļošana utt.

Iekļaušanas ķermeņiem nav bioloģiskas aktivitātes, nav jāuztraucas par olbaltumvielu aktivitātes zudumu, un liels ekspresijas daudzums neizraisīs šūnu nāvi un nepalielinās izturību pret proteāzes uzbrukumu. Jiuling dobo šķiedru var elastīgi izmantot iekļaušanas ķermeņu pakārtotajā attīrīšanas procesā. Iekļaušanas ķermeņa mazgāšanas solī izcila veiktspēja, salīdzinot ar centrbēdzes mazgāšanu, deviņu vecuma tehnoloģiju mikrofiltrācijas dobās šķiedras izmantošana tangenciālās plūsmas filtrēšanas mazgāšanai var ievērojami saīsināt procesa laiku, un vispārējais atkopšanas ātrums var sasniegt vairāk nekā 90%. Jiuling dobo šķiedru var izmantot arī iekļaušanas ķermeņu olbaltumvielu renaturācijas posmā. Ar mikrofiltrācijas dobo šķiedru filtrētā barības šķidruma duļķainība tiks ievērojami samazināta, un olbaltumvielu atgūšanas ātrums ir augsts; Ultrafiltrācijas dobās šķiedras izmantošana var ne tikai noņemt denaturantus, bet arī saīsināt hromatogrāfiskā parauga ielādes laiku, lai ietaupītu laiku, samazinātu pildvielas daudzumu un samazinātu ražošanas izmaksas. Mikrofiltrācijas/ultrafiltrācijas dobās šķiedras reģenerācijas ātrums dažādiem materiāliem atšķiras, un vispārējais reģenerācijas ātrums var sasniegt 90-95%.

Guidling Technology aicina jūs pieprasīt testa komplektus saistītajām atsauksmēm.

 

Par Guidlingu

Guidling Technology ir valsts augsto tehnoloģiju uzņēmums, kas koncentrējas uz biofarmaceitiku, šūnu kultūru, biomedicīnas attīrīšanu un koncentrēšanu, diagnostiku un rūpnieciskajiem šķidrumiem. Mēs esam veiksmīgi izstrādājuši centrbēdzes filtru ierīces, ultrafiltrācijas un mikrofiltrācijas kasetes, vīrusu filtru, TFF sistēmu, dziļuma filtru, dobu šķiedru utt., kas pilnībā atbilst biofarmaceitisko līdzekļu, šūnu kultūras un tā tālāk pielietojuma scenārijiem. Mūsu membrānas un membrānfiltrus plaši izmanto priekšfiltrācijas, mikrofiltrācijas, ultrafiltrācijas un nanofiltrācijas koncentrēšanai, ekstrakcijai un atdalīšanai. Mūsu daudzās produktu līnijas, sākot no mazas vienreizējas lietošanas laboratorijas filtrēšanas līdz ražošanas filtrēšanas sistēmām, sterilitātes pārbaudei, fermentācijai, šūnu kultūrai un citiem, atbilst testēšanas un ražošanas vajadzībām. Guidling Technology cer ar jums sadarboties!