Ultrafiltrācijas pielietošana cilvēku trakumsērgas vakcīnas ražošanā

Lai veicinātu ultrafiltrācijas pielietošanu cilvēka trakumsērgas vakcīnas ražošanā, tika izmantota 300kDa ultrafiltrācijas membrānas kasete, lai koncentrētu trakumsērgas vīrusa savākšanas šķīdumu un noteiktu antigēna atjaunošanos, endotoksīnu izvadīšanas ātrumu un saimniekproteīna izņemšanas ātrumu pēc ultrafiltrācijas. Rezultāti parādīja, ka pie atbilstoša spiediena trakumsērgas vīrusa savākšanas šķīdums tika koncentrēts 80 reizes, eluēts 25 reizes, antigēna atgūšanas ātrums bija 86,2%, baktēriju endotoksīnu izvadīšanas ātrums bija 87,5% ~ 88,7% un saimniekproteīna izņemšanas rādītājs bija 91,6%.

 

Priekšvārds

 

Trakumsērga ir tradicionāla, sena zoonotiska slimība, ko izraisa trakumsērgas vīruss (RV), ar mirstības līmeni līdz 100%. Pašlaik nav efektīvas ārstēšanas pēc iedarbības (ti, ādas un gļotādu bojājumiem), izņemot ārkārtas vakcīnu un imūnglobulīna vakcināciju. Galvenais trakumsērgas avots cilvēkiem ir slimu vai potenciāli inficētu dzīvnieku (galvenokārt suņu) kodumi. Mirstība no trakumsērgas Ķīnā ieņem otro vietu pasaulē, un trakumsērga ir viena no problēmām, kas apdraud sabiedrības veselības drošību mūsu valstī. Trakumsērgas vīrusa kapsulārais glikoproteīns, kas ir vienīgais galvenais antigēns, kas inducē aizsargājošu neitralizējošu antivielu veidošanos, ir bijis jaunu vakcīnu un jaunu trakumsērgas vīrusa diagnostikas un ārstēšanas tehnoloģiju izpētes un izstrādes uzmanības centrā.

 

Trakumsērgas vīruss pieder pie rabdovīrusu ģimenes trakumsērgas vīrusu ģints. Nukleokapsīda forma ir elastīga, nukleokapsīda ir spirāliski simetriska, un virsmai ir apvalks, kas satur vienpavedienu RNS. Tas ir patogēns, kas izraisa trakumsērgu. Trakumsērgas vīrusam ir divi galvenie antigēni: viens ir glikoproteīna antigēns uz vīrusa ārējās membrānas, kas var saistīties ar acetilholīna receptoriem, lai padarītu vīrusu neirotoksisku, un radīt neitralizējošas antivielas un hemaglutināciju inhibējošas antivielas organismā, un neitralizējošās antivielas. aizsargājošs efekts; Otrs ir iekšējais riboproteīna antigēns, kas var likt organismam ražot komplementu saistošas ​​antivielas un precipitīnu, un tam nav aizsargājošas iedarbības.

 

Endotoksīns ir lipopolisaharīda viela (LPS), kurai ir karstumizturība un ķīmiskā stabilitāte, un to nav viegli iznīcināt. Ja vakcīnā ir noteikta endotoksīna koncentrācija, tā pēc vakcinācijas izraisīs smagu drudzi un pat nāvi, tāpēc endotoksīna saturs vakcīnā ir pēc iespējas jāsamazina. Ķīnas farmakopejas 2005. gada izdevums (III daļa) noteica, ka trakumsērgas vakcīnas endotoksīna kvalificētā indeksa kontroles vērtība nedrīkst būt lielāka par 100 EU/devā. Strauji attīstoties membrānas atdalīšanas tehnoloģijai, farmācijas rūpniecībā arvien vairāk tiek izmantota ultrafiltrācijas membrānas atdalīšanas tehnoloģija, lai samazinātu endotoksīna saturu vakcīnās.

 

Trakumsērgas vakcīna ir vakcīna pret trakumsērgu. Parasti ir trīs veidu trakumsērgas vakcīnas, tostarp attīrīta Vero šūnu vakcīna, cilvēka diploīdu šūnu vakcīna un primārās šūnu kultūras vakcīna. Trakumsērgas vakcīna tiek izgatavota, inokulējot trakumsērgas vīrusu fiksētu vīrusu šūnu matricā pēc kultivēšanas, novākšanas, koncentrācijas, inaktivācijas, attīrīšanas un atbilstoša stabilizatora pievienošanas. Trakumsērgas vakcīnas galvenā funkcija ir stimulēt organismu radīt ātru imūnreakciju un ražot aizsargājošas antivielas pret trakumsērgas vīrusu, lai novērstu vīrusa izraisītu infekciju un samazinātu saslimšanas risku.

 

 

Vakcīnas kvalitātes nodrošināšanā liela nozīme ir vakcīnas ražošanas procesam, jo ​​īpaši svarīgāka ir atsevišķu indikatoru kvantitatīva noteikšana ražošanas procesā. Cilvēku trakumsērgas vakcīnas ražošanas procesā ultrafiltrācijas koncentrācijas tehnoloģija ir nepieciešams līdzeklis, lai ražotu cilvēku trakumsērgas vakcīnu. Izmantojot saprātīgu atvēruma ultrafiltrācijas membrānu ultrafiltrācijas koncentrācijai, var efektīvi noņemt endotoksīnu un saimniekproteīnu, kā arī saglabāt RV antigēnu, kas veicina vakcīnas ražošanu un kvalitātes uzlabošanos. RV molekulu relatīvā molekulmasa ir 350 kDa ~ 460 kDa, un teorētiski RV var pilnībā notvert ar ultrafiltrācijas koncentrāciju, izmantojot membrānas kaseti ar pārtveršanas molekulmasu 100 kDa un 300 kDa. Endotoksīns bieži veido agregātu struktūru dažādos ūdens šķīdumos, jo agregācijas pakāpes dēļ molekulu izmērs ir atšķirīgs. Endotoksīna monomēra relatīvā molekulmasa ir 10 kDa ~ 20 kDa, un tā polimerizācijas formas relatīvā molekulmasa ir 300 kDa ~ 1000 kDa vai vairāk nekā 1000 kDa. Pamatojoties uz molekulmasas atšķirību, RV antigēns cilvēka trakumsērgas vakcīnā tika saglabāts un endotoksīns un saimniekproteīns cilvēka trakumsērgas vakcīnā tika noņemti ar 300 kDa ultrafiltrācijas membrānu.

 

Šajā eksperimentā ultrafiltrācijas membrānas kasete ar 300 kDa apertūru un 0,11 m2 membrānas laukumu tika izmantota kā neliela parauga apstrāde, lai koncentrētu cilvēka trakumsērgas vakcīnas starpproduktus un membrānas plūsmu, ārstēšanas efektivitāti, koncentrācijas daudzveidību, antigēnu pārtveršanu, endotoksīnu izvadīšanu. , un tika pārbaudīta saimniekproteīna noņemšana.

 

2Materiāla metode

 

2.1. Eksperimentālie materiāli

Trakumsērgas vīrusa fiksēts vīrusa CTN-IV celms; Vero šūnas; 0,5M nātrija hidroksīds; 300kDa ultrafiltrācijas membrānas kasete (PES materiāls, 0,11 m² membrānas laukums).

 

2.2. Eksperimentālās metodes

2.2.1. Vīrusu savākšanas šķīduma sagatavošana

Saldētas Vero šūnas tika reanimētas siltā ūdenī 37-39 grādu temperatūrā, šūnu suspensija tika izdzerta un pēc tam pievienota 199 barotnei, kas satur 10% inaktivēta teļa seruma. Vienveidīgas viena slāņa šūnas tika kultivētas 37 grādos. CTN-IV celms tika inokulēts ar trakumsērgas vīrusu proporcijā 0,1 mol/L un kultivēts 37 grādu temperatūrā. Pēc 48 stundām barotne tika izmesta un tika pievienota 199 barotne, kas satur 0, 1% cilvēka asins albumīna, lai saglabātu kultūru 33 ° - 35 ° C temperatūrā. Ik pēc 3 d{16}}novāciet slimības indi un apvienojiet vairākus savākšanas šķidrumus.

 

2.2.2. Membrānas kasetes uzstādīšana

Uzstādiet membrānas kaseti un pievienojiet vadu, kā parādīts attēlā zemāk.

 

2.2.3. Ūdens mazgāšana

Aizveriet ieplūdes vārstu, atpakaļgaitas vārstu un caurplūdes vārstu un ievietojiet atgriešanas galu un cauruļu cauruli atkritumu šķidruma tvertnē. Piepildiet ieplūdes tvertni ar 1L ūdens injekcijām.

Atveriet ieplūdes un atgaitas vārstus, aizveriet caurejošos vārstus, atveriet sūkni, iztīriet atgaitas līniju ar 10% tilpuma attīrīta ūdens vai ūdens injekcijām un uzturiet ieplūdes spiedienu 0,35 bar (5psi).

Atveriet filtra vārstu, aizveriet atpakaļgaitas vārstu un izmantojiet atlikušo iesmidzināšanas ūdeni, lai notīrītu filtra cauruli, uzturot TMP pie 0,35 bar.

 

2.2.4 Dezinfekcija

Aizveriet ieplūdes vārstu, atgriezes vārstu un transmisijas vārstu un ievietojiet atgriešanas gala un transmisijas gala līnijas atkritumu šķidruma tvertnē. Piepildiet ieplūdes tvertni ar 2L tīrīšanas šķīduma.

Atveriet ieplūdes un atgaitas vārstus, aizveriet caurejošos vārstus, atveriet sūkni, iztīriet atgaitas līniju ar 200mL 0,5 M nātrija hidroksīda un uzturiet ieplūdes spiedienu 0,35 bāru (5 psi) līmenī. .

Atveriet caurejošo vārstu, aizveriet atpakaļgaitas vārstu un iztīriet caurejošo cauruli ar 200 mL tilpuma tīrīšanas šķīduma, uzturot TMP pie 0,35 bar.

Pēc tam atgaitas galu un cauruļu galu ievieto šķidruma tvertnē cikliskai tīrīšanai. Cikla tīrīšana ar 1 ~ 1,5 reizes lielāku procesa tangenciālo plūsmas ātrumu 30 minūtes.

Iztukšojiet 0,5 M nātrija hidroksīda un noskalojiet ar ūdeni injekcijām saskaņā ar 2.2.4. punktu, līdz tas ir neitrāls.

 

2.2.5. Ūdens plūsmas tests

Ielejiet ieplūdes tvertnē attīrītu ūdeni, izmēriet un pierakstiet ūdens temperatūru ieplūdes tvertnē. Ievietojiet atgriešanas galu tvertnē. Iedarbiniet sūkni un noregulējiet sūkņa ātrumu un atgriezes vārstu, lai sasniegtu 0,35 bar (5psi) transmembrānas spiediena starpību. Izmantojot cilindru, izmēra un reģistrē plūsmas ātrumu caurplūdes galā ml/min. Noregulējiet sūkņa ātrumu un atgriezes vārstu, lai iegūtu 1 bar (15 psi) transmembrānas diferenciālo spiedienu. Izmantojot cilindru, izmēra un reģistrē plūsmas ātrumu caurplūdes galā ml/min.

Lai standartizētu ūdens plūsmas vērtību, aprēķināto ūdens plūsmas vērtību sadaliet ar transmembrānas spiediena starpību un reiziniet temperatūras korekcijas koeficientu nākamajā tabulā.

 

2.2.6. Ultrafiltrācijas koncentrācija

Izskalojiet ūdeni no sistēmas ar bufera augšpusi. Ciklējiet 5 minūtes, lai pielāgotu sistēmas pH un jonu stabilitāti. Ja temperatūra ir jāpielāgo, turpiniet ciklu, līdz sistēmas temperatūra ir stabila.

Pievienojiet padeves šķidrumu ieplūdes tvertnei, iestatiet padeves plūsmas ātrumu (piemēram, 400 LMH) un pārbaudiet caurplūdes ātrumu ar dažādām TMP vērtībām. Saskaņā ar testa datiem līknes tika uzzīmētas ar TMP kā abscisu un Flux kā ordinātu.

Novietojiet cauruļu cauruli piemērotā tvertnē vai kanalizācijā, piemēram, savākšanas tvertnēs, atkritumu šķidruma tvertnēs un procesa notekcaurulēs.

Pierakstiet padeves šķidruma sākotnējo svaru padeves tvertnē, iedarbiniet padeves sūkni un lēnām cirkulējiet padeves šķidrumu 3–4 minūtes. Recirkulācija var palīdzēt noņemt atlikušo gaisu plūsmas ceļā, tādējādi palielinot plēves veiktspēju.

Atveriet caurejošo vārstu, lēnām palieliniet sūkņa ātrumu, līdz tiek sasniegts optimālais tangenciālās plūsmas ātrums, un noregulējiet atgriezes vārstu, lai sasniegtu sistēmas optimālo TMP.

Pēc tam ievietojiet cauruli savākšanas tvertnē, sāciet noteikt laiku, kad šķidrums nonāk tvertnē, un reģistrē ieplūdes un atgaitas spiedienu ar atbilstošiem intervāliem, kā arī reģistrējiet šķidruma kvalitāti laika gaitā atgaitas galā un cauri, lai aprēķinātu momentāno. plūsmas ātrums.

Parauga ultrafiltrācijas koncentrācija ir pabeigta, kad barības šķidruma tilpums tiek samazināts līdz mērķa koncentrācijas tilpumam.

 

2.2.7. Dialīze

Ievietojiet ieplūdes cauruli, papildināšanas cauruli un atgaitas cauruli ieplūdes tvertnē, ievietojiet pārvades cauruli savākšanas tvertnē un novietojiet savākšanas tvertni uz svariem, lai notīrītu.

Atveriet atpakaļgaitas vārstu, iedarbiniet ieplūdes sūkni, atveriet caurejošo vārstu, noregulējiet sūkņa ātrumu un TMP līdz atbilstošai vērtībai. Atveriet papildināšanas sūkni, nemainītu šķidruma tilpumu ieplūdes tvertnē un sāciet vienāda tilpuma dialīzi. Sāciet laiku, kad šķidrums nonāk tvertnē, un reģistrē spiedienu ieplūdes galā, atgaitas galā un šķidruma masu atbilstošā laika intervālā, un aprēķinot iegūstiet momentāno plūsmas ātrumu.

 

2.2.8. KIP

Vispirms noskalo ar buferšķīdumu, pēc tam noskalo ar ūdeni injekcijām (2.2.3. darbība), pēc tam notīra ar tīrīšanas līdzekli (2.2.4. darbība) un visbeidzot noskalo ar ūdeni injekcijām (2.2.3. darbība).

 

2.2.9. Ūdens plūsmas tests

Darbība ir šāda: 2.4.5.

 

2.2.10. Membrānas kasetes konservēšana

Īslaicīga uzglabāšana (mazāk par vai vienāds ar 3 dienām), turiet membrānas kaseti armatūrā un izmantojiet uzglabāšanas šķīdumu, lai ciklētu 10 min līdz 15 min, aizveriet sistēmas vārstu, pārtrauciet strāvas padevi šķidruma sūknim un nodrošiniet vai šķidruma ieplūdes tvertne ir pareizi noslēgta.

Ja uzglabāšanas laiks ir no 3 dienām līdz 1 mēnesim, lūdzu, izņemiet membrānas kaseti no armatūras un ievietojiet to plastmasas maisiņā vai citā hermētiskā traukā. Pievienojiet apmēram 50–100 ml uzglabāšanas šķīduma plastmasas maisiņā vai hermētiskā traukā un aizveriet to. Vai arī to var iegremdēt tieši uzglabāšanas šķīdumā. Nākamajā tabulā ir ieteikti uzglabāšanas apstākļi.

 

3 Rezultāti un analīze

 

3.1. Pirogēnu atdalīšanas efektivitāti ietekmējošo faktoru izpēte

Ultrafiltrācijas darbības spiediens: nepārtraukti tika veiktas 15 testa partijas. Katrā partijā filtrēšanas spiediens tika uzturēts 5, 10, 15 un 2{{10}} psi ultrafiltrācijas laikā, un vīrusa savākšanas šķidrums tika koncentrēts 30 reizes un eluēts ar buferšķīdumu. (10 reizes lielāks par tilpumu) nepārtrauktā plūsmā. Rezultāti, kā parādīts tabulā zemāk, endotoksīna izvadīšanas ātrums bija mazāks par 87,0%, antigēna atgūšanas ātrums bija stabils pie 86,0%, un saimniekproteīna izņemšanas ātrums bija stabils 90,0% apmērā, kas liecina. ka dažādie darbības spiedieni maz ietekmēja antigēna atgūšanas, endotoksīnu izņemšanas un saimniekproteīna izņemšanas ietekmi.

Ultrafiltrācijas koncentrācijas attiecība: nepārtraukti tika veiktas 15 testa partijas. Katrā partijā vīrusa savākšanas šķidrums ultrafiltrācijas laikā tika koncentrēts attiecīgi 30 reizes, 50 reizes, 80 reizes un 100 reizes. Filtrēšanas spiediens tika uzturēts 20 psi, un buferšķīdums (10 reizes lielāks par tilpumu) tika eluēts nepārtrauktā plūsmā. Rezultāti, kas parādīti nākamajā tabulā, endotoksīna izņemšanas ātrums svārstījās no 53,3% līdz 86,9%, antigēna atgūšanas ātrums saglabājās stabils (86,0%) un saimnieka proteīna izņemšanas ātrums. bija stabils 91.0% līmenī. Segmentētajā paraugu ņemšanā transmisijas šķīdumā netika atklāts antigēns, un koncentrētā vīrusa šķīdumā palika mazāk nekā 10% saimniekproteīna. Endotoksīna koncentrācija vīrusa koncentrētajā šķīdumā palielinājās, palielinoties koncentrācijas laikiem, un endotoksīna izvadīšanas ātrums bija lielākais koncentrētajā paraugā 80 reizes, un ražotājs varēja ņemt vērā arī 100 reižu koncentrāciju, kas ne tikai uzlaboja ražošanas efektivitāti un samazināja izmaksas, bet arī atbilda vakcīnu ražošanas prasībām.

 

3.2. Membrānas kasešu plūsmas samazināšanās un tīrīšanas reģenerācija

Pēc apstrādes membrānas plūsmas atgūšanas ātrums bija 92, 6%. Jaunās membrānas kasetes pirmais reģenerācijas ātrums ir normāls, saskaņā ar pašreizējām padeves šķidruma novērošanas īpašībām, turpmāko otrā un NTH laika prognozi, membrānas kasetes plūsmas atgūšanas ātrums pēc šīs apstrādes būs tuvu datiem, un mēdz būt stabils. 2 stundu laikā pēc vienreizējas lietošanas membrānas kasetes izsīkums bija ideāls, un tikai 10% no membrānas plūsmas tika iztērēti vispārējās darbības laikā.

3.2.1. plūsmas samazināšanās membrānas kasešu apstrādes procesā

3.2.2. Membrānas kasetes tīrīšanas un reģenerācijas rezultāts

 

Par Guidlingu

 

Guidling Technology ir nacionāls augsto tehnoloģiju uzņēmums, kas koncentrējas uz biofarmaceitiku, šūnu kultūru, biomedicīnas attīrīšanu un koncentrēšanu, diagnostiku un rūpnieciskajiem šķidrumiem. Mēs esam veiksmīgi izstrādājuši centrbēdzes filtru ierīces, ultrafiltrācijas un mikrofiltrācijas kasetes, vīrusu filtru, TFF sistēmu, dziļuma filtru, dobu šķiedru utt., kas pilnībā atbilst biofarmaceitisko līdzekļu, šūnu kultūras un tā tālāk pielietojuma scenārijiem. Mūsu membrānas un membrānfiltrus plaši izmanto priekšfiltrācijas, mikrofiltrācijas, ultrafiltrācijas un nanofiltrācijas koncentrēšanai, ekstrakcijai un atdalīšanai. Mūsu daudzās produktu līnijas, sākot no mazas vienreizējas lietošanas laboratorijas filtrēšanas līdz ražošanas filtrēšanas sistēmām, sterilitātes pārbaudei, fermentācijai, šūnu kultūrai un citiem, atbilst testēšanas un ražošanas vajadzībām. Guidling Technology cer ar jums sadarboties!