Pilna MRNA zāļu ražošanas procesa analīze: kā TFF tehnoloģija atrisina attīrīšanas problēmas
Pēdējos gados mRNS tehnoloģija ir sasniegusi izrāvienu biofarmācijas jomā, demonstrējot milzīgu pielietojuma potenciālu, jo īpaši vakcīnās un gēnu terapijā. Veiksmīgā mRNS vakcīnu izstrāde ir ne tikai nodrošinājusi jaunus risinājumus infekcijas slimību profilaksei un kontrolei, bet arī veicinājusi vēža imūnterapijas un personalizētās medicīnas attīstību. Tā kā ir jauna terapeitisko produktu klase, liela mēroga mRNS ražošana ir ļoti sarežģīta, jo tā ietver RNS stabilitātes kontroli, atlikušo enzīmu noņemšanu un reakciju ar produktiem, bufera apmaiņu un augstu tīrības pakāpes sasniegšanu, kam visam ir nepieciešamas ražošanas tehnoloģijas ar reglamentējošiem{5}}apstiprinātiem risinājumiem.
MRNS vakcīnu vai terapeitisko līdzekļu ražošanas process galvenokārt ir sadalīts trīs posmos: plazmīdas DNS lielapjoma šķīduma sagatavošana, mRNS lielapjoma šķīduma sagatavošana un mRNS-LNP zāļu sagatavošana.
mRNS zāļu ražošanas procesa blokshēma
Tangenciālās plūsmas filtrēšana (TFF) kā labi -izveidota membrānas atdalīšanas tehnoloģija tiek plaši izmantota mRNS ražošanā, pateicoties tās augstajai -efektivitātei molekulārajai sijāšanai, kontrolējamai bufera apmaiņai un zemām bīdes sprieguma īpašībām. Pamatojoties uz membrānas moduļu konstrukciju, izplatītās TFF konfigurācijas ietver plakanas-lokšņu kasetes un dobus-šķiedru moduļus. Turklāt membrānas atdalīšanu ar spiedienu -TFF var iedalīt mikrofiltrācijā (MF), ultrafiltrācijā (UF), nanofiltrācijā (NF) un reversajā osmozē (RO) atbilstoši membrānas poru izmēram, pakāpeniski palielinot selektivitāti.
TFF ir izšķiroša loma vairākos mRNS zāļu ražošanas posmos, tostarp plazmīdas DNS lielapjoma sagatavošanā, mRNS lielapjoma ražošanā un mRNS-LNP zāļu produktu galīgajā formulēšanā. Atbilstoši izvēloties membrānas tipu, molekulmasas robežvērtību (MWCO) un membrānas materiālu, TFF ļauj efektīvi noņemt reakcijas blakusproduktus un zemas-molekulāras- piemaisījumus, vienlaikus atvieglojot bufera apmaiņu un koncentrāciju gan pirms, gan pēc LNP iekapsulēšanas. Tas ievērojami uzlabo RNS tīrību, stabilitāti un kopējo procesa mērogojamību.
Turklāt tangenciālās plūsmas filtrēšanas veiktspēju ietekmē sistēmas konfigurācijas faktori, piemēram, sūkņa tips un cauruļu konstrukcija, kā arī galvenie procesa parametri, tostarp transmembrānas spiediens (TMP), bīdes spriegums un filtrēšanas plūsma. Šie faktori ir rūpīgi jāizvēlas un jāoptimizē, pamatojoties uz mērķa produkta īpašībām, jo īpaši attiecībā uz spriedzi jutīgiem produktiem, piemēram, mRNS–LNP, kas apstrādes laikā ir ļoti jutīgi pret ārējiem mehāniskiem spēkiem.
Plazmīdu DNS attīrīšana
Plazmīdas DNS izejas šķīduma sagatavošana pamatā ir balstīta uz transkripcijas veidnes secības dizainu. Sagatavošanas metodes parasti ietver plazmīdas DNS amplifikāciju, lai gan var izmantot arī PCR amplifikāciju. Kā piemēru ņemot DNS amplifikāciju, inženierijaE. coliparasti izmanto fermentācijas{0}}pastiprināšanai. Pakārtotais attīrīšanas process galvenokārt ietver šūnu savākšanu, līzi un dzidrināšanu, koncentrēšanu un bufera apmaiņu, sterilu filtrēšanu, linearizāciju un hromatogrāfisku attīrīšanu. Rūpnieciskos apstākļos šūnu savākšanai bieži izmanto nepārtrauktas -plūsmas centrifugēšanu, taču tā rada salīdzinoši lielus bīdes spēkus. Dobu šķiedru sistēmas ar atvērtiem kanāliem un zemu bīdes nobīdi ir vairāk piemērotas, lai apstrādātu paraugus ar augstu cietvielu saturu, augstu viskozitāti vai bīdes jutību, piemēram, plazmīdu DNS. Pēc savākšanas šūnas tiek pakļautas augsta spiediena homogenizācijai, ultraskaņai vai sārmainai līzei, kam seko iepriekšēja dzidrināšana, izmantojot dziļuma filtrēšanu.
Lai atvieglotu turpmāko hromatogrāfiju, koncentrēšanai un bufera apmaiņai bieži vispirms izmanto tangenciālās plūsmas filtrēšanu (TFF), izmantojot membrānas kasetes vai dobu šķiedru kolonnas ar molekulmasas atstarpi 30 kDa, 100 kDa vai 300 kDa. Tas samazina parauga tilpumu, vienlaikus noņemot dažus piemaisījumus, piemēram, RNS, saimniekšūnu proteīnus (HCP) un saimniekšūnas DNS fragmentus (HCD). Hromatogrāfija kalpo kā kodola attīrīšanas posms. Parasti anjonu apmaiņas hromatogrāfiju (AEX) apvieno ar hidrofobās mijiedarbības hromatogrāfiju (HIC), lai efektīvi noņemtu piemaisījumus un bagātinātu ļoti bioaktīvu superspirētu plazmīdas DNS, tādējādi ievērojami uzlabojot plazmīdas tīrību.
Pēc attīrīšanas plazmīdu vēlreiz pakļauj TFF, lai koncentrētu šķīdumu līdz mērķa koncentrācijai (parasti 0,5–2 mg / ml) un veiktu dialīzi ar galīgo uzglabāšanas buferi. Šajā posmā no procesa tiek noņemti atlikušie sāļi un organiskie šķīdinātāji, nodrošinot, ka bufersistēma atbilst pakārtoto in vitro transkripcijas (IVT) reakciju prasībām.
In vitro transkribētas (IVT) mRNS attīrīšana
In vitro transkripcija (IVT) un modifikācija ir galvenie procesi mRNS izejas šķīdumu pagatavošanai. IVT mRNS ražošanā tiek izmantota tangenciālās plūsmas filtrācijas (TFF1) – hromatogrāfijas – tangenciālās plūsmas filtrācijas (TFF2) kombinācija. Šī stratēģija nodrošina efektīvu un kvalitatīvu -mRNS attīrīšanu, nodrošinot būtisku atbalstu vakcīnu ražošanai.
Kad transkripcijas un modifikācijas reakcijas ir pabeigtas, vispirms parasti tiek veikta ultrafiltrācija/diafiltrācija, izmantojot membrānas kasetes vai dobās šķiedras kolonnas ar molekulmasas -nogriezni 30 kDa, 100 kDa vai 300 kDa. Šis solis efektīvi noņem no reakcijas sistēmas dažādus ar procesu saistītos piemaisījumus, piemēram, RNS polimerāzi, atlikušos DNS fragmentus, nereaģējušos NTP, ierobežojošos enzīmus, divpavedienu RNS (dsRNS) un mazo molekulu inhibitorus, vienlaikus panākot bufera apmaiņu. Pēc viena tangenciālās plūsmas filtrēšanas posma lielākā daļa piemaisījumu tiek efektīvi noņemti, un vienīgais nosakāmais atlikušais olbaltumvielu piemaisījums ir RNS polimerāze.
Pēc tam turpmākai attīrīšanai izmanto vairākas hromatogrāfijas metodes. Parasti izmantotās metodes ietver afinitātes hromatogrāfiju, izmēru-izslēgšanas hromatogrāfiju, jonu-pāru reversās-fāzes hromatogrāfiju un jonu-apmaiņas hromatogrāfiju. Izmantojot šo ultrafiltrācijas un secīgās hromatogrāfijas kombināciju, mRNS sasniedz augstu tīrības līmeni.
Lai izpildītu formulēšanas vai uzglabāšanas prasības, mRNS izejas šķīdumu atkal koncentrē vai atšķaida, izmantojot 30 kDa, 100 kDa vai 300 kDa membrānas kasetes vai dobās šķiedras kolonnas, lai precīzi pielāgotu mērķa koncentrāciju un apmainītu ar galīgo preparāta buferšķīdumu. Visbeidzot, lai kontrolētu mikrobu slodzi, tiek izmantota sterila-pakāpes filtrēšana, pabeidzot materiāla pagaidu uzglabāšanu un iepildīšanu.
Exploration of TFF-related process parameters: Relevant studies have shown that a membrane with a molecular weight cut-off (MWCO) of 100 kDa provides the optimal purification efficiency; the transmembrane pressure (TMP) should not exceed 5 psi; and an mRNA concentration of 1 mg/mL ensures a relatively high permeate flux (>25 LMH).
mRNS{0}}LNP preparātu attīrīšana
Lipīdu nanodaļiņas (LNP) pašlaik ir visplašāk pētītā piegādes sistēma mRNS terapijai. Pašlaik dažādi mRNS{1}}LNP preparāti atrodas dažādās preklīniskās un klīniskās izstrādes stadijās. LNP ir ļoti jutīgi pret ražošanas procesiem. Starp vienībām, kas nepieciešamas mRNS-LNP ražošanai, ievērojamas problēmas rada koncentrācija un bufera apmaiņa, izmantojot tangenciālās plūsmas filtrāciju (TFF), kā arī sterilo filtrēšanu. Šīs darbības ir rūpīgi jāoptimizē, lai nodrošinātu procesa mērogojamību un produkta kvalitāti, vienlaikus izvairoties no tādām problēmām kā membrānas piesārņojums un nepareiza filtra ielāde.
Pēc mRNS iekapsulēšanas attīrīšanai izmanto tangenciālās plūsmas filtrāciju (TFF). Šī posma mērķis ir noņemt neiekapsulētu mRNS, brīvos polimērus vai lipīdu materiālus, kā arī atlikušos šķīdinātājus no mRNS un lipīdiem. Tā kā mRNS-LNP ir ierobežota stabilitāte istabas temperatūrā, pakārtoto procesu, tostarp TFF, optimizācija ir ļoti svarīga produkta kvalitātes uzturēšanai.
Galvenie optimizācijas virzieni ietver: atbilstošu transmembrānas spiediena (TMP) un tangenciālās plūsmas ātruma iestatīšanu, pamatojoties uz mRNS{0}}LNP daļiņu izmēru un stabilitāti, lai līdzsvarotu filtrēšanas efektivitāti un daļiņu stresu; membrānu vai dobu šķiedru kolonnu atlase ar piemērotiem molekulmasas ierobežojumiem (MWCO, piemēram, 100 kDa vai 300 kDa), lai efektīvi noņemtu brīvo mRNS, piemaisījumus un apmaiņas buferi, vienlaikus samazinot daļiņu adsorbciju vai bojājumus; un optimizējot koncentrāciju un diafiltrācijas apjomus, lai nodrošinātu efektīvu bufera apmaiņu mērķa preparātā un kontrolētu daļiņu galīgo koncentrāciju un izkliedi.
Turklāt procesa laikā ir rūpīgi jāuzrauga kritiskie kvalitātes atribūti (piemēram, daļiņu izmērs, polidispersitātes indekss [PDI] un mRNS iekapsulēšanas efektivitāte), un parametri ir dinamiski jāpielāgo, pamatojoties uz reāllaika datiem, lai panāktu stabilu, mērogojamu un efektīvu mRNS{1}}LNP attīrīšanu un formulēšanu.
Turklāt mRNS{0}}LNP un to komponentu nestabilitātes dēļ, izmantojot terminālās sterilizācijas metodes, baktēriju un citu mikrobu piesārņotāju noņemšanai parasti izmanto 0,2 µm sterilu -gradu filtru.