Piesardzības pasākumi ultrafiltrācijas caurules lietošanai
(1) Izvēlieties atbilstošu ultrafiltrācijas cauruli. Parasti saglabājamā molekulmasa nedrīkst būt lielāka par 1/3 no mērķa proteīna molekulmasas. Piemēram, ja mērķa proteīna molekulmasa ir 35 kDa, var izvēlēties ultrafiltrācijas cauruli ar 10 kDa molekulmasu. Ja mērķa proteīna molekulmasa ir aptuveni 10 kd, var izmantot ultrafiltrācijas cauruli ar molekulmasu 3 kD. Uzmanīgi izlasiet lietošanas pamācību un pievērsiet uzmanību ultrafiltrācijas membrānas dažādajai tolerancei pret dažādām ķīmiskām vielām.
(2) Jauniegādātā ultrafiltrācija ir sausa. Pirms lietošanas pievienojiet īpaši tīru ūdeni, un ūdens pilnībā izies cauri membrānai. Dažas minūtes iepriekš atdzesējiet ledus vannā vai ledusskapī. Pēc tam izlejiet ūdeni un pievienojiet olbaltumvielu šķīdumu. Pievienotais daudzums nedrīkst pārsniegt balto līniju mēģenes augšpusē. Operācijai jābūt vieglai. Pirms olbaltumvielu šķīduma pievienošanas ultrafiltrācijas caurule ir jāievieto uz ledus priekšdzesēšanai.
(3) Bilance. Gan masai, gan smaguma centram jābūt līdzsvarā. Ņemiet vērā, ka ātrums un paātrinājums nedrīkst būt pārāk ātrs, pretējā gadījumā ultrafiltrācijas membrāna tiks tieši bojāta. Sāciet centrbēdzes ultrafiltrāciju (centrifūgas priekšdzesēšana līdz 4 grādiem). Pēc tam, kad dažādu centrifūgu apgriezieni tiek pārveidoti par G, tas atšķiras. Noregulējiet centrifūgas paātrinājumu uz zemāko pārnesumu, lai samazinātu spiedienu uz membrānu. Ņemiet vērā, ka pirms iziešanas no centrifūgas ir jāgaida, līdz centrifūga sasniedz mērķa ātrumu, pretējā gadījumā, ja rodas problēmas ar centrifūgu, jūs ar to nevarēsit tikt galā pirmajā reizē. Membrānas un rotējošās vārpstas virzienu noregulē saskaņā ar instrukcijām (leņķa rotācijas centrifūgas gadījumā membrāna ir perpendikulāra vārpstai). Praktiskā lietošanā ātrums parasti ir mazāks nekā rokasgrāmatā, kas var pagarināt centrbēdzes caurules kalpošanas laiku.
(4) Kad tas ir koncentrēts līdz atlikušajam 1 ml, paņemiet 50 ul buferšķīduma un pievienojiet 10 ul, lai izplūstu cauri, lai redzētu, vai tas kļūst zils, lai noteiktu, vai ultrafiltrācijas caurulē neizplūst proteīns. Ja caurulē ir noplūde, ielejiet augšējo slāni un plūstiet caur jauno cauruli un sāciet ultrafiltrāciju. Lai precīzi noteiktu, vai mēģenē nav noplūdes, centrifugējiet ar 5 mg ml BSA 10 minūtes, pēc tam izvadiet cauri, palaidiet proteīna līmi vai Bredfordu, lai veiktu aptuvenu mērījumu, un turpiniet pievienot atlikušo proteīna šķīdumu koncentrēšanai (darbiniet uz ledus, lai novērstu proteīna iekļūšanu). karsē), līdz tiek pievienoti visi koncentrētie šķīdumi. Pievērsiet uzmanību tam, vai centrifugēšanas laikā nenotiek olbaltumvielu nogulsnēšanās, kā rezultātā caurule bloķējas. Ja rodas nokrišņi, nosakiet konkrēto nokrišņu cēloni, vai olbaltumvielu koncentrācija ir pārāk augsta vai buferšķīdums nav piemērots; Pirmo var atrisināt, vienlaikus veicot ultrafiltrāciju ar vairākām ultrafiltrācijas caurulēm, lai samazinātu koncentrāciju. Pēdējais ir mainīt dažādus buferšķīdumus, līdz proteīns neizgulsnējas.
(5) Iepriekšējās darbības izmanto olbaltumvielu koncentrēšanai. Ja vēlaties mainīt buferšķīdumu, kad kopējais proteīna šķīdums ir koncentrēts līdz aptuveni 1 ml, uzmanīgi pievienojiet jaunu buferšķīdumu (ultrafiltrēšana caur 0,22 um ultrafiltrācijas membrānu) un pēc tam trīs reizes pēc kārtas koncentrējiet līdz apmēram 1 ml. Pēdējās koncentrācijas galīgais tilpums ir atkarīgs no nepieciešamās olbaltumvielu koncentrācijas, kas parasti nav lielāka par 500 ul, vai arī to var koncentrēt līdz 200 ul. Saskaņā ar tilpuma koncentrāciju, kas katru reizi ir vismaz 10 reizes, tā var sasniegt vairāk nekā 1000 reizes trīs reizes, kas būtībā var sasniegt bufera maiņas mērķi.
